Frontiers in Microbiology

Bevezetés

az Astroviridae család két nemzetségben, a Mamastrovírusban és az avastrovírusban nem burkol, pozitív érzékű, egyszálú RNS-vírusokat tartalmaz, amelyek emlősöket, illetve madarakat fertőznek meg. Jelenleg a vírusok taxonómiájának Nemzetközi Bizottsága (vírusok taxonómiájának Nemzetközi Bizottsága , 2018) 19 fajt ismer el, nevezetesen a Mamastrovirus-1-től -19-ig, a Mamastrovirus nemzetségen belül; azonban számos törzs vár osztályozásra, amelyek közül néhányat kísérleti jelleggel új fajnak tekintenek (Donato and Vijaykrishna, 2017).

2010 óta számos asztrovírust egyre inkább felismertek neuroinvazív különféle emlősfajokban, beleértve az embereket is (Quan et al., 2010; Naccache et al., 2015), nyérc (Blomstr Kb és mtsai., 2010), szarvasmarha (Li et al., 2013), juh (Pfaff et al., 2017), és sertések (Boros et al., 2017). A szarvasmarha asztrovírussal összefüggő encephalitis kezdeti felismerése után az Egyesült Államok szarvasmarháiban (Li et al., 2013), a Svájcból származó meghatározatlan etiológiájú sporadikus szarvasmarha-encephalitis eseteiben végzett retrospektív vizsgálat kimutatta, hogy ez a neuroinvazív asztrovírus évtizedek óta észrevétlen maradt (Selimovic-Hamza et al., 2016). Bár ezeknek az asztrovírusoknak az epidemiológiája és transzmissziós útvonala ismeretlen, a fajok közötti transzmissziót a magas azonossági szint (>98%) alapján javasolták, amely megoszlik a szarvasmarha és juh neuroinvazív asztrovírusai között nukleotid-és aminosav-szinten (Boujon et al., 2017).

szarvasmarhafélék asztrovírusai (BoAstVs), neve: BoAstV-NeuroS1 (Li et al., 2013) és a BoAstV-CH13 (Bouzalas et al., 2014), kezdetben nem gennyes encephalitisben szenvedő szarvasmarhák agyában találták az Egyesült Államokban, illetve Svájcban. A különböző nómenklatúra ellenére mindkét vírus ugyanazt a genotípusú fajt képviseli (Bouzalas et al., 2016; Selimovic-Hamza et al., 2017A), amely még mindig várja az ICTV hivatalos besorolását. 2015-ben egy korábban ismeretlen BoAstV törzset, a BoAstV-CH15 nevet azonosították a svájci encephalitisben szenvedő tehenek agyában. A teljes genom filogenetikai összehasonlítása a BoAstV-CH15 szorosabb kapcsolatát tárta fel egy juh asztrovírussal (OvAstV), mint a BoAstV-CH13-mal (Seuberlich et al., 2016). A BoAstV-CH13-mal és a BoAstV-CH15-tel való koinfekciót egy esetben is dokumentálták (Seuberlich et al., 2016). Ugyanebben az évben Németországban, Schlottau et al. (2016) egy új asztrovírusról számolt be, nevezetesen a BoAstV-BH89/14-ről egy agyvelőgyulladásban szenvedő tehénben, amely a legszorosabban kapcsolódott az OvAstV-hez és a BoAstV-CH15-hez. Ezt követően a BoAstV-CH13 / NeuroS1-et 2017-ben azonosították szarvasmarha-encephalitis eseteiben Kanada keleti és nyugati részén (Spinato et al., 2017; Selimovic-Hamza et al., 2017b). 2018-ban egy új, az észak-amerikai és az Európai BoAstV-NeuroS1/BoAstV-CH13-mal szoros rokonságban álló neuroinvazív Büszkélkedést azonosítottak egy nem gennyes encephalomyelitisben szenvedő tinóban Japánban, és javasolták az észak-amerikai és az Európai törzsek közötti intra-genotípusos rekombináció előfordulását (Hirashima et al., 2018).

míg Észak-Amerikában, Európában és Ázsiában jelentettek asztrovírussal összefüggő encephalitis eseteket, a déli féltekén soha nem dokumentálták jelenlétüket. Itt egy uruguayi szarvasmarháknál előforduló asztrovírussal összefüggő encephalitis esetét írjuk le, amely kiszélesíti a neuroinvazív asztrovírusok földrajzi eloszlását és genetikai sokféleségét, és filogeográfiai bizonyítékokat szolgáltat, amelyek arra utalnak, hogy ezt a vírust Európából vezették be Amerikába, majd később Ázsiába terjedt.

anyagok és módszerek

Előzmények és jelzések

2018 júniusában egy 22 hónapos Holstein kormányzott egy 37 tinóból álló csoportban egy 300 hektáros kolóniai farmon, Uruguayban, progresszív neurológiai énekeket fejlesztett ki, beleértve a szokatlan viselkedést, a céltalan járást, a körözést, az ataxiát, az ismétlődő és koordinálatlan nyelvmozgásokat és a recumbenciát. Az állomány egy éves zablegelőn legelt, amelyet kukoricaszilázs egészített ki. Az állatgyógyász feltételezett klinikai diagnózisa az agyi listeriosist penicillinnel és sztreptomicinnel kezelte, azonban az állat spontán elpusztult egy 3 napig tartó klinikai kúra után.

patológiai vizsgálat, in situ hibridizáció (ISH) és immunhisztokémia (IHC)

a tinó fejét kivették a hasított testből, és diagnosztikai munka céljából az INIA állat-egészségügyi diagnosztikai laboratóriumába (Animal Health Platform) továbbították. Az agy felét, a proximális nyaki gerincvelő (C1) rövid szegmensét, a trigeminális ganglionot és a trigeminus ideg gyökerét, a nyálmirigyet, a retropharyngealis nyirokcsomót, az oropharynxet, a nyelőcsövet, a nyelvet és a vázizomot 10%-os semleges pufferolt formalinba rögzítették 48-72 órán keresztül. a szöveteket rutinszerűen feldolgozták szövettan céljából, paraffinba ágyazták, mikrotómát metszettek 4-5 km-en, hematoxilinnel és eozinnal festették (H&E) és Gram foltok.

kromogén ish-t manuálisan végeztük a formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) brainstem, cerebrum és cerebellum 5 fő szakaszán Superfrost Plus tárgylemezeken (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Egyesült Államok) Az RNAscope 2.5 Red assay kit (Cat #322360, Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, Egyesült Államok) és a BoAstV probe Cat segítségével. #406921. A szonda 20zz párból áll, amelyek a vírus 5232-6180 régióját célozzák (GenBank KF233994.1). A szövet minden egyes 5 db-os szakaszát hővel és proteázzal előkezeltük a próba hibridizációja előtt 2 órán át 40 db C-on, és a gyártók ajánlásainak megfelelően dolgoztuk fel. A jel validálásához használt negatív kontrollok közé tartozott egy független (GC-tartalomhoz illeszkedő) szonda, amelyet Soros szakaszokon futtattak, valamint a nem fertőzött állatok szövetének szondázása. A diákat hematoxilinnel ellensúlyozták, és EcoMount-tal szerelték fel (Biocare Medical, Concord, CA, Egyesült Államok).

ezenkívül az IHC-t az agytörzs, a cerebrum és a cerebellum FFPE szakaszain végezték, amint azt korábban leírtuk, a nyugat-nílusi vírus (WNV, flavivírus) azonosítására (Palmieri et al., 2011), veszettség vírus (Lyssavirus) (Stein et al., 2010) és a Chlamydia spp. (Giannitti et al., 2016) antigének.

molekuláris virológia

a nukleinsav extrakciót fagyasztott (-20 C) agy összesített mintájából végeztük Magmax nukleinsav izolációs készlet alkalmazásával (Thermo Fisher Scientific). Az asztrovírus kimutatásához reverz transzkripciót (RT) végeztek a Revertaid reverz transzkriptáz (Thermo Fisher Scientific) és random hexamer primerekkel (Qiagen). A PCR-t cDNS-ből MangoMix (Bioline) és primerek segítségével végeztük, amelyek az asztrovírus polimeráz gén 432-nukleotid fragmentumát amplifikálják (Tse et al., 2011). A PCR terméket 2% – os agaróz gélben vizualizáltuk, PureLink ons gyors gél extrakció és PCR Purification Combo Kit (Invitrogen) alkalmazásával tisztítottuk, majd a Macrogen Inc. – nél szekvenáltuk. (Szöul, Dél-Korea). Az asztrovírus teljes genom amplifikációjához a Maxima H mínusz reverz transzkriptáz (Thermo Fisher Scientific) és az oligo(dT)18 a cDNS obtentiójához, valamint a MangoMix (Bioline) vagy a Ranger DNS polimeráz (Bioline) hirashima és munkatársai által leírt primerekkel., 2018, használták. A PCR termékeket 1-2% – os agaróz gélben vizualizáltuk, tisztítottuk és szekvenáltuk a fent említettek szerint. A szekvencia összeszerelését a SeqMan (Lasergene 8, DNASTAR). Huszonhat teljes genom szekvenciák neuroinvazív asztrovírus szarvasmarha, juh, sertés, ember és nyérc, és bélben oldódó szarvasmarha asztrovírus elérhető GenBank letöltötték és összehangolták a CLUSTAL W MEGA 7 szoftver (Kumar et al., 2016). W-IQ-TREE1 (Trifinopoulos et al., 2016) a szekvencia evolúció legjobban illeszkedő modelljének (SYM+I+G4) meghatározására és egy maximális valószínűségű filogenetikai fa felépítésére használták az ebben az esetben kimutatott dicsekvés majdnem teljes szekvenciáival, valamint a Genbankból letöltött teljes szekvenciákkal, a bootstrap segítségével statisztikai módszerként a kládok robusztusságának értékelésére. Hasonlóság telek végeztünk SimPlot szoftver (Lole et al., 1999). A P-távolságokat az ORF2 aminosav szintjén MEGA 7 szoftverrel becsülték meg (Kumar et al., 2016).

ezenkívül egy bayesi filogeográfiai elemzést végeztünk a BEAST v1.8.4 csomaggal (Drummond et al., 2012), használata: a BoAstV CH13/NeuroS1 vonal, az ORF1ab (nem strukturális gének), az ORF2 (strukturális gén), az ORF1a (proteáz) és a részleges ORF1b (polimeráz Genom régió, amelyhez Kanadai törzsek álltak rendelkezésre) teljes kódoló régiója, a GenBank összes szekvenciájával (utolsó csatlakozás április 18, 2019), hogy meghatározzák az evolúciós sebességet, a közös ősök életkorát/éveit, és a víruskeringés legvalószínűbb útját országonként (Svájc, Uruguay, Egyesült Államok, Kanada és Japán). A rekombináció hiányát az adatkészletben rekombinációs detektáló programmal határoztuk meg 4. Az egyes igazításokhoz legjobban illeszkedő szubsztitúciós modellt MEGA 7 szoftverrel határoztuk meg a Bayes-i információs kritérium (BIC) értékein keresztül, és az egyes adatkészletek időbeli szerkezetét a TempEst segítségével értékeltük (Rambaut et al., 2016). A lognormal relaxed molecular clock with Bayes Skyline analysis-t a Bayes Factor választotta ki a molekuláris órák és a coalescent tree priors különböző kombinációi közül. A kimutatás országát használták tulajdonságként. A Markov lánc Monte Carlo hossza 100 millió generáció volt, biztosítva az elemzés konvergenciáját, amelyet a Tracer v1.6 Értékelt.0, a hátsó valószínűséget pedig a kládok értékelésére használták. A maximális clade hitelességi fát (MCCT) a BEAST TreeAnnotator szoftverével szereztük be, és a FigTree v1.4.3-ban jelenítettük meg.

végül a fagyasztott agyból kivont DNS-t PCR-rel dolgozták fel a szarvasmarha herpeszvírusok 1 és 5 (BHV-1 és -5) kimutatására, amint azt korábban leírtuk (Ashbaugh et al., 1997).

Bakteriológia

a cerebrum és az agytörzs friss mintáit rutinszerűen dolgozták fel aerob baktériumtenyészetekhez a vérben és a MacConkey agarokban, valamint szelektív tenyésztéshez Listeria monocytogenes (Al-Zoreky and Sandine, 1990).

eredmények és megbeszélések

az itt leírt eset klinikai tünetei és epidemiológiai megállapításai, bár nem specifikusak, hasonlóak voltak a szarvasmarha asztrovírussal összefüggő encephalitis egyéb eseteiben leírtakhoz, amelyet általában szórványosnak neveznek (Selimovic-Hamza et al., 2016), különféle neurológiai hiányokkal (Deiss et al., 2017), A klinikai tünetek időtartama általában 1 naptól 3 hétig terjed (Schlottau et al., 2016; Deiss et al., 2017; Spinato et al., 2017; Hirashima et al., 2018).

az agy, a gerincvelő C1 szegmensének és a fej egyéb szöveteinek makroszkópos vizsgálata nem tárt fel jelentős bruttó anatómiai elváltozásokat. Szövettanilag közepes vagy súlyos, lymphocytás, histiocytás és plazmacytás meningoencephalomyelitis volt, amely a telencephalont (beleértve az agyféltekét és a hippocampust), az agytörzset és a gerincvelő egyetlen vizsgált szegmensét érintette. A léziók túlnyomórészt a szürkeállományban és a fehérállomány határos területein oszlottak el. Az érintett területeken perivascularis mandzsetta, lymphoplasmacytic és histiocytás gyulladás, valamint neuronális nekrózis/neuronophagia fordult elő gliosissal a szomszédos neuropilban. Az érintett, nekrotikus neuronok satellitózisa volt (1a–D ábra). A cerebelláris parenchyma esetében a léziók sokkal kevésbé voltak gyakoriak és súlyosak, bár volt multifokális mérsékelt cerebelláris leptomeningitis. Nem találtak intralesionális baktériumokat H& E és Gram foltokkal. A többi vizsgált szövetben nem találtak jelentős szövettani változást.

neuroinvazív vírusfertőzés gyanúja merült fel a központi idegrendszer szövettani vizsgálata során. Az encephalitisben szenvedő szarvasmarhák aggodalomra adnak okot, mivel sok kérődző neuropatogén zoonózis (Cantile and Youssef, 2016); így az encephalitis diagnózisának kiterjedt laboratóriumi vizsgálatokat kell végeznie a fertőző ágensek szűrésére, ha lehetséges. Az itt leírt esetben a WNV, a veszettség vírus és a Chlamydia spp. és a BHV-1 és -5 PCR mind negatív volt, és az agyszövetből nem tenyésztettek patogén baktériumokat. Mivel a tinó < 2 éves volt, és nem figyeltek meg szivacsos elváltozásokat az agytörzsben, az állatot nem vizsgálták szarvasmarhák szivacsos agyvelőbántalmára (BSE), amely a felnőtt szarvasmarhák egzotikus betegsége, amelyet soha nem jelentettek Uruguayban. Ezenkívül a BSE nem gyulladásos (Cantile and Youssef, 2016).

az In situ hibridizációt a BoAstV-NeuroS1–ből előállított szondával végeztük, és a szonda hibridizációja bőséges volt az agyfélteke és a hippokampusz neuronjainak citoplazmájában (1e-G ábra). Ezeken a területeken a szonda hibridizációja kolokalizálódott nekrotikus neuronokkal és a gliosis régióival, a szonda hibridizációja nem mutatható ki a gliasejtekben vagy a perivaszkuláris mandzsetta gyulladásos sejtjeiben. Az ISH nem mutatott vírus nukleinsavat a kisagyban, amelynek csak minimális gyulladásos elváltozásai voltak a parenchyma, de mérsékelt leptomeningitis, vagy az agytörzs, beleértve a súlyos gyulladásos szakaszokat is. Ez azt jelenti, hogy topográfiailag a víruseloszlás ISH általi kimutatása korlátozottabb volt, mint az encephalitis a vizsgált szakaszokban, amelyet alkalmanként a szarvasmarhákban a BoAstV-CH13/NeuroS1-hez társuló encephalitis eseteiben írtak le (Selimovic-Hamza et al., 2017A, b). Ennek oka a vírus RNS kimutatásának alkalmi hiánya az agy sérült területein lehet az ISH kimutatási határa, vagy a vírus kiürülése az agy gyulladt területein a halál idejére, amint azt korábban javasolták (Selimovic-Hamza et al., 2017b). Ahogy az várható volt, az ISH nem mutatott ki szonda hibridizációt a negatív kontrollként használt agyszövetben.

Asztrovírust mutattak ki az agyban RT-PCR-rel. A majdnem teljes genomszekvencia-elemzés egy Mamastrovírus törzset tárt fel a CH13 / NeuroS1 kládon belül, amelyet BoAstV-Neuro-Uy-nak neveztünk el, a szekvenciát Genbankba helyezték az MK386569 csatlakozási szám alatt. A filogenetikai elemzés feltárta a közelséget más neuroinvazív asztrovírusokkal a Virginia / Human-Mink-juh (VA/HMO) kládon belül (2.ábra), amely a legismertebb neuroinvazív asztrovírusokat tartalmazza (Hirashima et al., 2018; Reuter et al., 2018). A Dicsekvésv-Neuro-Uy szinte teljes szekvenciája 6427 bp hosszúságú, szekvenciaazonossága 94% a KagoshimaSR28-462 törzzsel. A hencegésv-Neuro-Uy hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint a CH13/NeuroS1 törzs többi törzse: 5 ‘ UTR régió 51 nt, ORF1a (proteáz) 861 aminosav (aa), ORF1b 523 aa (RNS-függő RNS polimeráz) és ORF2 758 aa (kapszid fehérje). Sajnos a 3 ‘ UTR-T nem lehetett szekvenálni, de feltételezhető, hogy poli(a) farok van jelen, mert oligo(dT)18-at használtunk a cDNS előállításához. Ezenkívül jelen van a heptamerikus aaaaaac szekvencia, egy riboszomális kereteltolódási jel. A P-távolságok az ORF2 aminosav szintjén megerősítették ennek a törzsnek a CH13/NeuroS1 kládhoz való hozzárendelését. P-távolság < 0.35 a BoAstV-Neuro-Uy és a klád többi tagja között (1.táblázat) támogatná e vírustörzsek ugyanazon fajon belüli osztályozását; a Mamastrovirus-13-at nemrégiben más szerzők javasolták (Donato and Vijaykrishna, 2017; Hirashima et al., 2018), bár az ICTV által meghatározott Fajok kijelölése függőben van. Az ISH-hoz használt, a BoAstV-NeuroS1-ből előállított szekvencia 92,7%-os azonossággal rendelkezett a BoAstV-Neuro-Uy-val.

a neuropatológiai vizsgálatokon és az asztrovírus nukleinsav-és fehérje kimutatásán alapuló vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy valószínű ok-okozati összefüggés van az asztrovírus fertőzés és a szarvasmarhák neurológiai betegsége és elváltozásai között (Selimovic-Hamza et al., 2017A; Reuter et al., 2018). Legjobb tudomásunk szerint az asztrovírussal összefüggő encephalitis kísérletileg még nem reprodukálódott. Ehhez szükség lenne a neuroinvazív asztrovírusok izolálására a klinikai esetekből,amelyet esetünkben nem próbáltunk meg.

a dicsekvés forrásav-Neuro-Uy ebben az esetben nem lehetett meghatározni. Figyelembe kell azonban venni a víztározó szarvasmarhákat és a vadon élő állatokat, mivel a szarvasmarhákat kiterjedt szabadtéri körülmények között nevelték fel. Az érintett állatot 2018 februárjában vásárolták meg és szállították a gazdaságba a többi 9 tinóval együtt. Sajnos a tulajdonos megtagadta a további mintavételt és más állatok vizsgálatát az ingatlanban, és részletesebb epidemiológiai vizsgálatot. A csoport többi állatának egyikében sem alakult ki neurológiai betegség 2018 augusztusától, amikor utoljára kapcsolatba léptek az állatorvossal. A tél elejétől a tavasz végéig szezonalitást javasoltak az asztrovírussal összefüggő encephalitis eseteire Svájcban (Selimovic-Hamza et al., 2016). Érdekes módon az itt leírt eset júniusban történt, amely megfelel a déli féltekén az őszi-téli átmeneti időszaknak.

míg a neurotróp asztrovírusokat Észak-Amerikában azonosították (Li et al., 2013; Spinato et al., 2017), Európa (Bouzalas et al., 2014) és Ázsia (Hirashima et al., 2018), jelenlétükről soha nem számoltak be a déli féltekén, ezért ez a kommunikáció kiszélesíti az asztrovírussal összefüggő encephalitis földrajzi eloszlását. Annak felmérésére, hogy az Uruguayban kimutatott vírustörzs Európából, Észak-Amerikából vagy Ázsiából származhatott-e, megbecsültük az evolúciós sebességet, és filogeográfiai elemzést végeztünk a GenBank-ban elérhető neuroinvazív büszkélkedő szekvenciák felhasználásával. A teljes kódolási régió felhasználásával becsült evolúciós sebesség volt 4.27 60-4 (95% – os legnagyobb valószínűségi sűrűség-HPD -, 2,19-6,46 10-4) nukleotid szubsztitúciók/hely/év, ami egy RNS vírus esetében várható (Jenkins et al., 2002), de alacsonyabb, mint az enterális humán asztrovírusok becsült értéke (Babkin et al., 2012, 2014). A ORF1ab régió mutatott hasonló evolúciós sebesség (4.20 × 10-4, 95% – os a RENDŐRSÉG 1.66–6.46 × 10-4 helyettesítések/site/év), mint a teljes kódoló régióban, míg a ORF1a (2.92 × 10-4, 95% – os a RENDŐRSÉG 1.19 × 10-6-6.46 × 10-4 helyettesítések/site/év), valamint az ORF2 (2.86 × 10-4, 95% – OS a RENDŐRSÉG 4.13 × 10-6-5.79 60-4 szubsztitúció / hely / év) valamivel gyorsabb evolúciós sebességet mutatott, a parciális polimeráz genomi régió (ORF1b) pedig kissé lassabb evolúciós sebességet mutatott (5,39 10-4, 95% HPD 6,41 10-7-1, 10 10-3 szubsztitúció/hely/év).

a teljes kódolási régióval végzett filogeográfiai analízis alapján, és az MCTT-ben (3.ábra) látható, két olyan alvonal van (CH13 és NeuroS1), amelyek referencia törzseken alapulnak, és amelyeknek közös ősük van. Ezeknek az alcsaládoknak a legújabb közös őse (CH13/NeuroS1 vonal) Európában körülbelül 1885-ben keletkezett (95% HPD, 1794-1940). Az 1900-as évek elején a két alvonal szétvált, a CH13 alvonal Európában keringett, míg a NeuroS1 alvonal Amerikában és Ázsiában terjedt el. A legvalószínűbb forgatókönyv az, hogy a NeuroS1 alcsaládot Uruguayban vezették be Európából 1921 körül (95% HPD, 1849-1967), feltehetően állattenyésztés útján, majd Észak-Amerikába, később Japánba terjedt (3.ábra). A Genbankban rendelkezésre álló szekvenciák számának korlátozása miatt, amely torzíthatta az elemzést, a teljes kódoló régió felhasználásával kapott eredményeket összehasonlítottuk más genomiális régiókkal (ORF1ab, ORF2, ORF1a és ORF1b), amelyek nagyobb számú törzsre (azaz Kanadai törzsekre) állnak rendelkezésre. Az összes elemzésben a legvalószínűbb forgatókönyv az, hogy a vírus Uruguayba történő bevezetése Európából történt (S1A–D kiegészítő adatok). Ezen túlmenően az ORF1ab és a parciális polimeráz genomi régióval (orf1b) kapott bevezetés becsült dátuma (S1A, D kiegészítő adatok) hasonló volt a teljes kódoló régióval kapott dátumhoz,míg az ORF2 és ORF1a esetében a bevezetés becsült dátuma korábbi volt, de szélesebb, 95% – os HPD-intervallummal (S1B,C kiegészítő adatok). A NeuroS1 alvonal Európából közvetlenül Kanadába történő bevezetése, majd az Egyesült Államokba és Japánba való elterjedése szintén elfogadható, s ezt az S1D kiegészítő ábra mutatja.

további vizsgálatokra van szükség a neuroinvazív asztrovírusok földrajzi eloszlásának, patogén mechanizmusainak (különösen a transzmisszió és bejutás mechanizmusainak), molekuláris epidemiológiájának és lehetséges Fajok közötti transzmissziójának felméréséhez.

adatok elérhetősége

a tanulmányhoz létrehozott adatkészletek megtalálhatók a GenBank, MK386569.

szerzői hozzájárulások

FG, RDC és MC hozzájárult a koncepció a tanulmány. Az FG és az RDC elvégezte a patológiai vizsgálatot és a mintavételt. A PP elvégezte az in situ hibridizációt. FU elvégezte az immunhisztokémiát. Az LM, az RC és az MC molekuláris virológiai vizsgálatokat végzett. Az MC elvégezte a szekvencia-és filogeográfiai elemzéseket és a kapcsolódó számokat. Az FG és a PP megkapta a szövettani képeket. Az MF elvégezte a baktériumtenyészeteket. FG és MC írta a kézirat első vázlatát. RDC, PP, FU, LM, MFÉS RC írta a kézirat részeit. Minden szerző hozzájárult a kézirat felülvizsgálatához, elolvasta és jóváhagyta a benyújtott verziót.

finanszírozás

ezt a munkát az INIA PL-015 N-15156 támogatásából, valamint az “Iniciaci Programa a la Investigaci Adapnic 2017 “támogatásból, a” Comisiaz Iniciaci Sectorial de Investigaci Adapnic (CSIC) ” 158 támogatásából finanszírozták. Az MC és az RDC elismeri a” Nemzeti Kutatási és Innovációs Ügynökség ” (ANII) és az INIA támogatását Ph.D. ösztöndíjak. Az FG elismeri az ANII támogatását a mov_ca_2018_1_150021 mobilitási támogatás révén.

összeférhetetlenségi nyilatkozat

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

a TS recenzens a Pp egyik szerzőjével fennálló korábbi társszerzői kapcsolatot jelentette be a kezelő szerkesztőnek.

Köszönetnyilvánítás

a szerzők köszönetet mondanak YISELL Perdomónak és Cecilia Monesigliónak INIÁBÓL, valamint Karen Sverlownak és Juliann Beingessernek a cahfs-től a technikai segítségért.

Kiegészítő anyag

a cikk kiegészítő anyaga megtalálható az interneten: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01240/full#supplementary-material

S1. ábra / a teljes hosszúságú ORF1ab (A), A teljes hosszúságú ORF2 (B), a teljes hosszúságú ORF1a (C) és a részleges ORF1b (D) elemzésével kapott maximális klád-hitelességi fák (Mcct-k). Az ágak színe azt a legvalószínűbb országot képviseli, ahol az ősök keringtek, a hátsó valószínűségi értékek az ágakban jelennek meg, az egyes csomópontokban szereplő számok pedig az egyes kládok származási éveit képviselik a 95% – os HPD intervallummal. Az alcsaládokat címkék jelzik.

lábjegyzetek

1. ^http://iqtree.cibiv.univie.ac.at