Genetikai keresztek
a genetikai kereszt két egyed céltudatos párzása, amely az utódok genetikai anyagának kombinációját eredményezi. A keresztezéseket számos modellrendszerben lehet elvégezni—beleértve a növényeket, az élesztőt, a legyeket és az egereket—, és felhasználhatók genetikai folyamatok boncolására vagy új tulajdonságokkal rendelkező organizmusok létrehozására.
ez a videó bemutatja a genetikai keresztek néhány alapelvét, megvizsgálja a tetrad analízis néven ismert keresztezések elvégzésének egyik módszerét, és megvitatja ennek a technikának számos alkalmazását.
először mutassuk be az öröklés alapelveit, amelyek lehetővé teszik a genetikai keresztezést.
egy szervezet fenotípusát vagy tulajdonságainak összetételét befolyásolja genetikai felépítése vagy genotípusa. A legtöbb nemi úton szaporodó organizmusban a szülői generáció haploid ivarsejteket termel, amelyeknek minden egyes kromoszómából egy példánya van. Ezek a párzás során összeolvadnak, hogy diploid utódokat hozzanak létre az egyes kromoszómák két homológ másolatával. Ha mindkét kromoszóma ugyanazt az allélt vagy egy gén variáns formáját tartalmazza, akkor a szervezet “homozigóta” abban a genetikai lokuszban; másképp, “heterozigóta.”
a ciklus újbóli megkezdéséhez a diploid organizmus meiózis útján ismét haploid ivarsejteket generál. E folyamat során a két homológ kromoszóma “rekombináción” megy keresztül, ahol egyenértékű szekvenciák bitjei cserélődnek a pár között. Ez a folyamat összekeveri az egyes utódok által örökölt szülői allélokat, ezáltal növelve genetikai sokféleségüket.
az egyik első ember, aki szisztematikus genetikai keresztezést végzett, a “genetika atyja”, Gregor Mendel volt. A könnyen manipulálható borsó növény felhasználásával és az öröklődés következetes mintáival rendelkező tulajdonságok sorozatának vizsgálatával Mendel három alapvető öröklési törvényt tudott levezetni, amelyek a genetika alapját képezik.
Mendel első törvénye az egységesség törvénye, amely kimondja, hogy két homozigóta egyén első vagy F1 generációjának heterozigóta utódainak csak egy szülő fenotípusa lesz. Az ezt a fenotípust létrehozó allélt “dominánsnak” nevezik, míg a “rejtett” allél “recesszív.”Ma már tudjuk, hogy a dominancia kapcsolatok gyakran kevésbé egyértelműek, olyan esetekkel, mint a hiányos dominancia, ahol a heterozigóták kevert fenotípust fejeznek ki; és kodominancia, ahol mindkét fenotípus megjelenik.
A szegregáció törvénye kimondja, hogy minden ivarsejthez véletlenszerűen egy allélt rendelnek. Megfigyelve, hogy a heterozigóta F1 egyedek önmegtermékenyítéséből származó F2 utódok a 3:1 fenotípusos arány, de hogy a fenotípusosan domináns egyének közül kettő valójában heterozigóta, Mendel arra a következtetésre jutott, hogy a két szülői allélt külön kell örökölni. Ma már tudjuk, hogy a szegregáció a meiózis során következik be, amikor a diploid szülő két homológ kromoszómája véletlenszerűen haploid leánysejtekre oszlik, amelyek mindegyike a két allél egyikét örökli.
Mendel harmadik törvénye a független választék törvénye, amely kimondja, hogy az egyéni tulajdonságok egymástól függetlenül öröklődnek. Most már tudjuk, hogy az abszolút függetlenség csak a haploid halmaz külön kromoszómáin lévő gének által vezérelt tulajdonságok esetében létezik, amelyek a meiózis során egymástól függetlenül oszlanak meg a leánysejtekben. Ugyanazon kromoszómán lévő két gén esetében a köztük lévő távolság fordítottan arányos annak valószínűségével, hogy különböző homológ kromoszómákra rekombinálódnak, és kiterjesztéssel, mennyire valószínű, hogy ugyanazon utódokban együtt öröklődnek. Ezért a diploid organizmus négy meiotikus termékének elemzése lehetővé teszi a tudósok számára a gének helyének feltérképezését.
a genetikai keresztek mögött meghúzódó elvek áttekintése után vessünk egy pillantást a tetrad analízis protokolljára.
ezt a technikát jellemzően bizonyos egysejtű algákra vagy gombákra, például élesztőre alkalmazzák a négy haploid meiotikus termék vagy spórák boncolására, amelyek ezekben a fajokban “tetrádként” együtt maradnak egyetlen sejttesten belül.
az élesztőben végzett tetrad analízis elvégzéséhez a kívánt törzseket először megfelelő táptalajon tenyésztjük. Az egyes kolóniákból származó élesztősejtek párosodhatnak, például úgy, hogy az egyes törzseket keresztmintában csíkozzák egy új tányéron. Ezt a lemezt ezután szelektív közegre replikálják, hogy csak a kereszt diploid termékét izolálják.
a kiválasztott diploid sejteket tápanyagszegény táptalajon tenyésztik, hogy sporulációt és tetrádképződést indukáljanak. Az asci-t, amelyek a spórák tetrádjait tartó struktúrák, a zimolyáz enzimet tartalmazó oldatokban emésztjük. Az emésztést követően az egyes asci-ket tetrád-boncoló mikroszkóppal manipulálják. Ezek meghatározott helyeken vannak elrendezve egy növekedési lemezen, és megszakítják az egyes spórák felszabadítását. Ezeket rácsszerű mintába lehet helyezni, ahol minden spóra egyedi kolóniát hozna létre, amelyet tovább lehet elemezni.
most, hogy tudja, hogyan történik a tetrad-elemzés, vizsgáljuk meg ennek a technikának a sok alkalmazását vagy módosítását.
a tetrádok kézi boncolása időigényes, és a kutatók nagy áteresztőképességű alternatívákat dolgoztak ki, mint például a tetrádok vonalkód-alapú szekvenálása. Ebben a módszerben az élesztőkereszt diploid utódait plazmidkönyvtárral transzformáltuk, amelyek mindegyike tartalmaz egy rövid, egyedi “vonalkód” néven ismert szekvenciát, amely minden utód azonosítójaként működik. A plazmidok GFP-t is expresszálnak, lehetővé téve az élesztő asci kiválasztását áramlási citometriával, és az agar lemezekre rendezését. Az asci-t tömegesen lizálták a lemezeken, és a spórák kis kolóniákká növekedtek. A telepeket ezután véletlenszerűen elosztottuk 96 lyukú lemezekre genotipizálás céljából. Az egyedülálló szekvencia vonalkód lehetővé teszi a kutatók számára, hogy csoportosítsák az egyes tetrádok spóráiból származó négy telepet.
a genetikai keresztek felhasználhatók élesztősejtek előállítására is, nagyszámú gén delécióval. A green monster folyamat során a GFP-vel jelölt különböző géntörléseket hordozó haploid mutáns élesztőt párosítják és sporulálják. Ezek a haploid utódok, amelyek közül néhány mindkét szülőtől örökölt deléciókat hordoz, fluoreszcencia-aktivált áramlási citometriával vannak rendezve, ahol kimutatták, hogy a GFP intenzitása korrelál az adott élesztőtörzs delécióinak számával. Ezeket a kiválasztott sejteket ezután tenyésztették és újra keresztezték. Ennek a ciklusnak a megismétlése számos törlést tartalmazó élesztőtörzset eredményezett.
végül a genetikai keresztezéseket számos modellrendszerben alkalmazták, például a maláriát okozó intracelluláris parazita Plasmodium. Mivel a parazita csak más sejtekben képes szaporodni, minden keresztezési lépést egerekben vagy szúnyogokban kell végrehajtani, a parazita természetes gazdaszervezetében, illetve vektorában. Itt az egereket két egyedi Plasmodium törzzsel fertőzték meg a vérparazita szakaszában. A paraziták ezután vérrel táplálkozva átkerültek a szúnyogokba, és miután beléptek, ivarsejtekké érlelődtek, amelyek megtermékenyítették a diploid zigótákat. Az érett sporozoitákat ezután a szúnyogból szedték ki, és a na Evolve egerek megfertőzésére használták, ahol a parazitákat szaporították az érdekes kereszt utódok izolálására.
most nézted JoVE videóját a genetikai keresztekről. Ebben a videóban bemutattuk az öröklődés alapelveit, azt, hogy egyes organizmusok genetikai keresztezései hogyan elemezhetők tetrád boncolással, valamint néhány aktuális alkalmazást. Mint mindig, köszönöm, hogy megnézted!