Kreatív proteomikai Blog
a fehérje vagy peptid aminosavainak szekvenciáját az Edman degradációval lehet azonosítani, amelyet Pehr Edman fejlesztett ki. Ez a módszer képes megjelölni és hasítani a peptidet az N-terminálisról anélkül, hogy megszakítaná a peptidkötéseket más aminosavmaradékok között. Az Edman-féle degradációs reakciót 1967-ben Edman és Beggs automatizálta. Manapság széles körben alkalmazzák az automatizált Edman degradációt (a fehérje szekvenátort), amely akár 50 aminosav peptideket is képes szekvenálni.
a peptidek ciklikus lebomlása a fenilizotiocianátnak az N-terminális maradék szabad aminocsoportjával való reakciója alapján oly módon, hogy az aminosavakat egyenként eltávolítják, és feniltiohydantoin-származékaiként azonosítják. A specifikus eljárással kapcsolatban egy töltetlen peptidet reagáltatunk fenilizotiocianát (PITC) az amino terminálon enyhén lúgos körülmények között, hogy feniltiokarbamoil-származékot (PTC-peptid) kapjunk. Ezután savas körülmények között a származék tiokarbonil-kénje megtámadja az N-terminális aminosav karbonil-szénét. Az első aminosavat anilinotiazolinon-származékként (ATZ-aminosav) hasítják, a peptid fennmaradó részét izolálhatjuk és a következő lebomlási ciklusnak vethetjük alá. Miután kialakult, ez a tiazolon-származék stabilabb, mint a feniltiokarbamil-származék. Az ATZ aminosavat ezután etil-aceráttal történő extrakcióval eltávolítják, majd feniltiohydantoin-származékká (PTH-aminosav) alakítják. A kromatográfia felhasználható az egyes ciklusok által generált PTH maradék azonosítására.
ami az automatizált Edman lebomlást illeti, a fehérjéket úgy lehet elemezni, hogy oldatban alkalmazzák őket egy TFA szűrőre, majd betöltik az Edman szekvenáló műszer. A keverékekben lévő fehérjéket először 1D vagy 2D gélekkel választják el, majd egy PVDF membránra blotálják. A fehérjéket coomassie blue, Amido black vagy Poncau festéssel detektálják, a kérdéses fehérjéket kivágják, és a PVDF membrándarabot betöltik az Edman szekvenszerre.
tömegspektrometriával fejlesztették ki az Edman degradációs szekvenálás alkalmazását. Az IT stills azonban továbbra is a fehérje szerkezeti elemzésének többféle módszere. Használható a rekombináns fehérjék N-terminális határának ellenőrzésére vagy a proteázrezisztens domének N-terminálisának meghatározására, különösen akkor, ha a fehérje vagy domén >40-80 kDa, vagy nem tisztítható könnyen. Azt is fel lehet használni, hogy azonosítsa az új N-terminális és proteolitikus hasítási hely a fehérje fragmentumok. Ezenkívül néhány új fehérje és peptid esetében, ahol szekvencia adatbázisok nem állnak rendelkezésre az MS / MS adatbázis kereséséhez, az Edman degradáció használható elemzésre.
a fehérje N-terminális aminosavja lebontható. Így a folyamat során az első ciklus így azonosítja a pontos N-terminális aminosavat. Továbbá, mivel a felszabadult aminosavakat kromatográfiával azonosítják és számszerűsítik, azonos molekulatömegű aminosavak azonosíthatók. Például az izoleucin és a leucin tömege 113 Da, de eltérő retenciós idővel rendelkeznek. Ezenkívül az Edman szekvenálás 1D és 2D gélek PVDF blotjain is elvégezhető, ami lehetővé teszi a fehérjék N-terminális szekvenálását a keverékben. Az Edman degradációs szekvenálás azonban nem lesz elérhető, ha az a peptid, amelynek N-terminálisát kémiailag módosították, például acetilezés. És mivel a PITC nem képes reagálni a nem-aminosavakkal, a szekvenálás leáll, ha egy nem-6-aminosavval találkozunk, mint izoaszpartinsav. Sőt, nagyobb fehérjéket nem lehet szekvenálni az Edman szekvenálással.
a Creative Proteomics-nál professzionális fehérjeszekvenálási platformunk N-terminális szekvenciaanalízist biztosít Edman degradációval vagy tömegspektrometriával (MS), egymást kiegészítő előnyökkel. Nagy tapasztalattal rendelkező szakértői csapatunk segít megérteni, hogy mit próbál kivizsgálni, és megfelel az Ön igényeinek. Ezenkívül más fehérjeazonosító szolgáltatásokat is nyújthatunk, beleértve:
- peptid tömeg ujjlenyomat (PMF) szolgáltatás
- peptidek vagy fehérjék Szekvenciaelemzése
- de novo fehérje szekvencia analízis szolgáltatás
- sörétes puska fehérje azonosító szolgáltatás
- membrán proteomikai szolgáltatás