Mi az a Southern Blotting?

írta: Hannah Simmons, M. Sc.áttekintette: Kate Anderton, B.Sc. (szerkesztő)

a blotolás az a folyamat, amelynek során a DNS, az RNS vagy a fehérjék átkerülnek egy membránra, hogy láthatóvá váljanak.

hitel: Paul Cowan/.com

az első ilyen módszer a Southern Blotting volt, amelyet Edward Southern fejlesztett ki 1975-ben, és a DNS-fragmensek szekvenciájának kimutatására használják. Azóta két másik módszert fejlesztettek ki, az úgynevezett Northern És Western blot. Ezek olyan folyamatok, amelyeket az RNS, illetve a fehérje szekvenciák azonosítására használnak.

A Southern blot módszertana

a DNS-fragmenseket kezdetben restrikciós enzimekkel állítják elő, majd méretük szerint elválasztják egy gélelektroforézisnek nevezett eljárás során. Ezután lúgot használnak a kettős szálú DNS denaturálására, egyetlen szálat képezve. A DNS-t ezután nitrocellulózra vagy nejlonlapra helyezzük úgy, hogy egy membránt helyezünk a gél fölé, és a puffer áramlását használjuk a DNS mozgásának ösztönzésére a gélből a membránba.

a kapilláris áramlás és a vákuumtranszfer a két leggyakoribb módszer a DNS-fragmentumok átvitelére. A kapilláris áramlásban a gélt a puffer szintje fölé helyezzük egy tartótömbön, amelynek tetején egy membrán található. Ezután egy halom abszorbens törölközőt helyeznek a membrán fölé, és a puffer felszívására használják a gél alól, felemelve a DNS-fragmenseket a membránra.

vákuumtranszfer alkalmazásával a membránt a gél alá helyezzük, és mindkettőt pufferbe merítjük. Ezután vákuumot használnak olyan áramlás létrehozására, amely lehúzza a DNS-fragmenseket a membránra.

ezután melegítést vagy UV-sugárzást alkalmaznak annak biztosítására, hogy a DNS-fragmensek tartósan a membránhoz kapcsolódjanak, miközben fenntartják a DNS specifikus elrendezését. Ezután egyszálú jelölt próbákat használnak a célszekvenciákhoz való kötődéshez.

a lapot ezekkel a szondákkal inkubáljuk, és csak a komplementer szondák kötődnek. A nem komplementer szondákat ezután lemossák a membránról, biztosítva, hogy csak a kötött szondák maradjanak. Ezeket a próbákat ezután autoradiográfiával detektálhatjuk, hogy felfedjük a hibridizáció mintáját egy röntgenfilmen.

Alkalmazások Southern blotting

Southern blotting számos különböző felhasználási. Először is, a gén átrendeződések elemezhetők. Például az immunológiában ez a módszer felhasználható a T-sejt receptor gének klonális átrendeződéseinek azonosítására. Másodszor, a DNS specifikus fragmensei sok más fragmens keverékéből azonosíthatók.

további felhasználási példák közé tartozik mind a restrikciós fragmentum hosszúságú polimorfizmus (RFLP), mind a változó számú tandem ismétlés (VNTR) elemzése. Az RFLP a homológ DNS-szekvenciák hosszbeli különbségeit használja a genomok feltérképezésére, és felhasználható törvényszéki és apasági tesztekben.

a VNTR analízis az ismételt nukleotidszekvenciák hosszának különbségeit használja a DNS-ujjlenyomat kialakításához, ezt a módszert gyakran használják az apasági és a törvényszéki vizsgálatokban.

ezek a módszerek felhasználhatók a mutáció által okozott betegség diagnosztizálására is, például sarlósejtes vérszegénység. Ez a genetikai állapot a béta-globin gén egyetlen nukleotid polimorfizmusának (A-tól T-ig) köszönhető, ami abnormális hemoglobint eredményez.

Déli blot törékeny X szindróma esetén

a déli blotokat széles körben alkalmazták az amplifikált ismétlődő régiókkal rendelkező gének azonosítására. Ezek rövid, ismétlődő szekvenciák a DNS-ben, amelyek nem kódolják a géntermékeket. Az egyik példa, ahol a déli blot hasznos lehet, A törékeny X-szindróma diagnosztizálása. Ez a genetikai állapot a CGG/CCG ismétlődő régió növekedésének köszönhető, amely az FMR1 génen belül található.

ez a gén általában 5-40 ismétlődő régiót tartalmaz. Az 55-200 ismétléssel rendelkező egyének FMR1 gén premutációval rendelkeznek, a >200 ismétléssel rendelkező egyének pedig törékeny X szindrómával rendelkeznek. Az ismétlődések növekedése a gén metilációjához vezet, ami gátolja a transzkripciót és megakadályozza az FMRP fehérje termelését. Ez a fehérje szükséges az idegrendszer normális működéséhez, ezért a fehérje funkció elvesztése a törékeny X-szindróma tüneteihez vezet.

a diagnózis során a metilezésre érzékeny eclx1 restrikciós enzimet és a Metilezésre nem érzékeny EcoR1 enzimet használják a metilezett allélek és a nem metilezett allélek differenciálásának lehetővé tételére. A metilezett allélokat csak egyszer vágják le, hogy 5,1 kb-os egyedi DNS-fragmentumot kapjanak.

a nem metilezett allélokat azonban kétszer vágjuk, így 2,8 kb-os fragmentumot kapunk. A nem metilezett premutációs ismétlődések (<200) tehát megkülönböztethetők a körülbelül 200 ismétlés hosszú metilezett mutációs ismétlődésektől, mivel a déli blot segítségével meghatározható a DNS-fragmensek mérete.

jövőbeli kilátások

összességében a déli blotolás fontos módszer a betegségek (például a törékeny X-szindróma és a sarlósejtes vérszegénység) diagnosztizálásában és tanulmányozásában, valamint a DNS más okokból történő elemzésében (például törvényszéki és apasági vizsgálat).

a déli blotolás azonban technikailag nagyon összetett, drága, fáradságos és nagy mennyiségű DNS-mintát igényel. Az új módszerek tehát lassan helyettesítik a déli blottot, például a valós idejű PCR-t. Ez a folyamat sokkal könnyebb és gyorsabb, mint a déli blotolás, és csak nagyon kis mennyiségű DNS-t igényel.

további olvasmányok

• minden genetikai tartalom
• mi a genetika?
• a genetika története
• genetika és génexpresszió
• genetikai változás

írta:

Hannah Simmons

Hannah egy orvosi és élettudományi író egy Master of Science (M.Sc.) diploma a Lancaster Egyetemen, Egyesült Királyság. Mielőtt író lett volna, Hannah kutatása az Alzheimer-kór és a Parkinson-kór biomarkereinek felfedezésére összpontosított. Azon is dolgozott, hogy tovább tisztázza az ezekben a betegségekben részt vevő biológiai útvonalakat. A munkáján kívül Hannah szeret úszni, sétálni viszi a kutyáját és bejárja a világot.

Idézetek