Proteináz K
kalciummal aktiválva az enzim a fehérjéket elsősorban hidrofób aminosavak (alifás, aromás és egyéb hidrofób aminosavak) után emészti. Bár a kalciumionok nem befolyásolják az enzimaktivitást, hozzájárulnak annak stabilitásához.A fehérjék teljesen emészthetők, ha az inkubációs idő hosszú és a proteázkoncentráció elég magas. A kalciumionok eltávolításakor az enzim stabilitása csökken, de a proteolitikus aktivitás megmarad. A proteináz K-nak két kötőhelye van a Ca-Hoz2+, amelyek az aktív központ közelében helyezkednek el, de nem vesznek részt közvetlenül a katalitikus mechanizmusban. A maradék aktivitás elegendő a fehérjék emésztéséhez, amelyek általában szennyezik a nukleinsavkészítményeket. Ezért a nukleinsavak tisztítására szolgáló proteináz K-val történő emésztést általában EDTA jelenlétében végezzük (fémionfüggő enzimek, például nukleázok gátlása).
a proteináz K széles pH-tartományban (4-12) is stabil, pH-értéke 8,0.A reakció hőmérsékletének 37 6XC–ról 50-60 oC-ra történő emelése többször is növelheti az aktivitást, mint például 0,5-1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) vagy Guanidinium-klorid (3 M), Guanidinium-tiocianát (1 M) és karbamid (4 M) hozzáadása. A fent említett körülmények fokozzák a proteináz K aktivitását azáltal, hogy a szubsztrát hasítási helyeit hozzáférhetőbbé teszik. A hőmérséklet meghaladja a 65cc, triklór-ecetsav (TCA) vagy a szerin proteáz-inhibitorok AEBSF, PMSF vagy DFP gátolják az aktivitást. A proteináz K-t nem gátolja a Guanidinium-klorid, a Guanidinium-tiocianát, a karbamid, a Sarkosyl, a Triton X-100, a Tween 20, az SDS, a citrát, a jód-ecetsav, az EDTA vagy más szerin proteáz inhibitorok, például a Na-Tozil-Lys Klórmetil-keton (TLCK) és a Na-Tozil-Phe Klórmetil-keton (TPCK).
proteáz k aktivitás általánosan használt pufferekben
| puffer (pH = 8,0, 50 C, 1,25 KB/mL proteáz K, 15 perc inkubáció) | proteináz k aktivitás (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% Tween 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |