tirozináz
8.14.2.2.4 tirozináz (EC 1.14.18.1) és katekol-oxidáz (EC 1.10.3.1)
tirozináz, amely egy olyan fehérjecsaládhoz tartozik, amelynek katalitikus központja a 3-as típusú dinukleáris réz által alkotott, katalizálja a tirozináz ortohidroxilezését monofenol, majd a Difenol Termék ezt követő oxidációja a kapott Kinonná.178 reakciók sorozata következik be a molekuláris oxigén vízzel történő egyidejű redukciója alatt. A kinon termék reaktív prekurzor a melanin pigmentek szintéziséhez. A tirozináz, amely zöldségekben, gyümölcsökben és gombákban található, kulcsfontosságú enzim a barnulásban, amely véraláfutás vagy hosszú távú tárolás esetén jelentkezik. Emlősöknél az enzim felelős a bőr pigmentációs rendellenességeiért, például pöttyökért és hibákért.179 így a tirozináz igen jelentős a mezőgazdaság és az ipar területén. A kozmetikai iparban a tirozináz erős inhibitorainak fejlesztése és szűrése különösen vonzó.
a tirozináz a 3-as típusú rézfehérje családba tartozik, csakúgy, mint a katekol-oxidáz és a légzőszervi pigment hemocianin. A katalitikus reakció során a tirozináz 3-as típusú rézközpontja három redox formában létezik.178 a dezoxi forma(Cu(I)–Cu (I)) redukált faj, amely az oxigént megköti, hogy oxi formát kapjon(Cu(II)–O22–Cu (II)). Oxi-formában a molekuláris oxigén peroxidként kötődik a (Z) A (Z) A (z) o-o kötést destabilizáló és aktiváló (o-o) módhoz. A met formát (Cu(II)–Cu(II)) nyugalmi enzimatikus formaként feltételezzük, ahol a Cu(II) ionokat általában egy kis ligandumba, például vízmolekulába vagy hidroxidionba hidalják át.
a katekol-oxidáz az Orto-difenolokat a megfelelő kinonokká oxidálja, de nincs monooxigenáz vagy krezoláz aktivitása. A hemocianin oxigénhordozóként működik ízeltlábúakban és puhatestűekben.
meghatározták a Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268-ból származó tirozináz és az Ipomoea batatas180 édesburgonyából származó katekol-oxidáz kristályszerkezetét. Megerősítik, hogy a tirozinázban és a katekol-oxidázban a 3-as típusú réz hely koordinációja nagyon hasonló a hemocianinban találhatóhoz. Ezt korábban a spektroszkópiai tulajdonságok hasonlóságából, valamint számos tirozináz és hemocianin primer szerkezet összehasonlításából vonták le.181-183 a fehérjék biológiai forrása alapján hét különböző doménszervezetet lehetett azonosítani. A különböző organizmusok növényi katekol-oxidázainak szekvenciaazonossága körülbelül 40-60%. A katekol-oxidázok és a mulluscan hemocianinok közötti szekvenciaazonosság a szekvenciák majdnem teljes hosszában körülbelül 35%. Ezzel szemben a növényi katekol-oxidázok és más, nem növényi eredetű 3-as típusú rézfehérjék szekvenciaazonossága a két rézkötő régióra korlátozódik.
a két rézkötő régió a legmagasabb megőrzést mutatja az összes 3-as típusú rézfehérjében. Különösen a régiókötő CuB erősen konzervált, míg a CuA-kötő régió több szekvenciaváltozatot mutat, és felelős a tirozináz, a katekol-oxidáz és a hemocianin különböző funkcióiért.
a tirozináz általános szerkezete S-ből. castaneoglobisporus komplex nyitott olvasó keret ORF378 ábrán látható 23. A tirozináz az enzim magjával rendelkező, négy hélix köteg által alkotott hexagonikus szerkezeteket veszi fel. A katalitikus dinukleáris rézközpont a spirális kötegben helyezkedik el (23.ábra). Az aktív helyen lévő két rézion mindegyikét három His-maradék koordinálja (24. ábra), amelyek a his54 kivételével a His-köteg négy hélixéből származnak. Egy rézion (cua) koordinálja a his38, His54 és His63. A his38 és a His63 a 2., illetve a 3. szám közepén helyezkedik el. A második rézion (CuB) a His190, His194 és His216 koordinálja. A his190 és His194 maradékok a 6. szám elején és közepén vannak, his216 pedig a 7.szám közepén. Ez a dicopper központ a nagy konkávság alján helyezkedik el feltételezett szubsztrátkötő zsebként, amelyet a hidrofób maradékok képeznek. A spirális szerkezet mellett a tirozináznak van néhány a gerinc torziós szögei alapján megítélve. Ezekben csak az n – és a C-terminális adapterek alkotnak lapszerkezetet.
23. ábra. A Streptomyces castaneoglobisporus tirozináz szalagdiagramja komplexben ORF378-mal (PDB-kód: 1WX3). A tirozináz és az ORF378 rózsaszín, illetve málna. A CuA és CuB rézionokat sárga gömbként ábrázolják; Pymollal készítették (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
24. ábra. A tirozináz aktív központjának met formája a Streptomyces castaneoglobisporus-ból (PDB-kód: 1wx3); Pymollal készítve (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
bár a tirozináz aminosav-szekvenciája csak 25,3,illetve 26,0% – os azonossággal rendelkezik, mint az I. batatas katechol-oxidáz180 és az Octopus dofleini hemocianin odg doménje, 184, általános szerkezete meglehetősen hasonló az övékhez. E három fehérje közül magas fokú megőrzés figyelhető meg a 6-kötegből álló magdoménben. A tirozináz és a hemocianinok a Panulirus interruptus185 és L. a polyphemus66 nem mutat szignifikáns homológiát és nem hasonlít a szerkezetükre, de ezeknek a fehérjéknek a katalitikus magdoménjei egymásra helyezhetők.
az S. castaneoglobisporusból származó tirozináz esetében az aktív hely öt különböző állapotát jellemezhetjük kristályszerkezetekben, nevezetesen rézmentes formában, met I formában, met II formában, dezoxiban és oxiban. Az I. batatas katekol-oxidáz kristályszerkezeteiben a met-és dezoxi-állapotokat, valamint egy inhibitor komplexet tisztáztak. Met állapotban (Cu (II), Cu(II)) a két rézion 2 távolságban van.9 db, mindegyiket három histidine koordinálja. Egy másik atom, valószínűleg egy hidroxid-ion áthidalja őket, körülbelül 1,8 ^ távolságra minden egyes réziontól, így mindegyiknek 4-es koordinációs száma van (lásd a 24.ábrát, amely ugyanazt a helyzetet mutatja tirozináz tól től S. castaneoglobisporus). Dezoxi vagy redukált állapotban mindkét rézatom + 1 oxidációs állapotban van. A réz-réz távolság 4,4^. A koordinációs számok 4 a CuA (három hisztidin ligandum és egy koordináló vízmolekula) és 3 a CuB (három hisztidin ligandum) esetében. A koordinációs szféra torz trigonális piramis a CuA esetében, a négyzet sík a CuB esetében (az OH áthidaló által elfoglalt koordinációs hely− a met állapotban üres). A feniltiourea–val (PTU) végzett inhibitor komplexben a réz-réz távolság 4,2-re növekszik, míg a PTU kénatomja helyettesíti a MET állapot hidroxóhídját. A két réz koordinációs szférája hasonló marad a met állapotéhoz, de az aktív helymaradványoknál konformációs változások vannak. A legjelentősebb változás a phe261 aromás gyűrűjének forgása (katekol-oxidáz számozás).
a met állapothoz képest a koordináló maradékok redukált állapotban csak kissé eltérő helyzetben vannak, ami meglehetősen merev zsebre utal. A koordináció változásai a zsebben lévő rézatomok mozgásával járnak. Az inhibitor komplex azt mutatja, hogy a Phe261 az aktív hely felett helyezkedik el, mint egy kapu, amely az inhibitor megkötése után forog. Így úgy tűnik, hogy a szubsztrátumnak a katalitikus fémközponthoz való hozzáférését ez a ‘kapumaradék’szabályozza.
a tirozináz katalitikus mechanizmusát először Solomon et al.178 Salamon egy mechanizmust javasolt mind a krezoláz, mind a katekoláz tirozináz aktivitására (25.ábra). Ez a mechanizmus azt sugallja, hogy az oxi állapot a krezoláz aktivitás (belső kör) kiindulópontja. Ez az állapot a tirozináz nyugalmi formájában körülbelül 15% arányban van jelen (85% met állapot). A monofenol szubsztrát az oxi állapothoz kötődik, és monooxigénezett o-difenollal. Ez a difenol ezt követően a met tirozináz rézközpontjához kötődik egy modellvegyület alapján javasolt bidentátkötési módban.188 a difenol szubsztrát oxidációja a dinukleáris rézközpont redukált állapotához vezet. A redukált állapot oxi állapotba történő újraoxidálása a dioxigén támadásával történik, és lezárja a katalitikus ciklust.
25. ábra. A tirozináz és a katekol-oxidáz krezoláz és katekoláz aktivitásának mechanizmusát Salamon és munkatársai kezdeti javaslata178 alapján fejlesztették ki, és újabb eredményeket tartalmaztak.186 187 reprodukálva C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Kémia. Res.2002, 35, 183-191, az American Chemical Society engedélyével.
a katekoláz aktivitás mechanizmusa (külső kör) az oxy és a met állapotokból indul ki. A difenol szubsztrát kötődik a met állapothoz (például), majd a szubsztrát oxidációja az első kinonhoz és az enzim redukált állapotának kialakulása. A dioxigén kötődése az oxi állapothoz vezet, amelyet később a második difenol molekula megtámad. A második kinonná történő oxidáció ismét a met állapotot képezi, és lezárja a katalitikus ciklust.
az alternatív reakciómechanizmusok közé tartozik a Kitajima és a Morooka189 által javasolt radikális mechanizmus, valamint a modellvegyületek mérésein alapuló cu(III) intermedier.190 a katekol–oxidáz-PTU inhibitor komplex kristályszerkezete alapján a szubsztrát monodentátkötését javasolták a katekol-oxidáz esetében.180 Az Octopus vulgaris hemocianin gyenge katekolázaktivitására javasolt radikális mechanizmus, 191 a katekol-oxidáz esetében is lehetséges az I. batatas katekol-oxidáz és az odg hemocianin közötti erős szerkezeti kapcsolat miatt, amint azt fentebb leírtuk.
a katekol-oxidáz és a tirozináz közötti különbséget még nem magyarázták. A tirozináz monofenoláz aktivitásának lag fázisát találták és tanulmányozták, és a feltételezések szerint a tirozináz met állapotának a monofenol szubsztrát feleslegével történő átmeneti gátlásának eredménye (25.ábra).186 a Monofenoláz aktivitása növekszik, amikor a difenol termék kiszorítja a monofenolt a MET tirozinázból, és lehetővé teszi a katalitikus ciklus folytatását. A katekol-oxidáz izolált formájában kizárólag met állapotban van jelen, és a fenol is gátolja. Ezért azt javasolták, hogy az oxi állapot hiánya az oka annak, hogy a katekol-oxidáz nem rendelkezik krezoláz aktivitással. Mivel az oxi katekol-oxidáz szintén nem mutat monooxigenáz aktivitást, ez a magyarázat nem tűnik teljesen kielégítőnek. Egy másik lehetséges ok az, hogy a CuA-hoz való hozzáférés,amelyet a monofenolok oxigénellátásához javasoltak, 192 blokkolva van az I. batatas katekol-oxidáz kristályszerkezetében.