Hvad er Southern Blotting?

af Hannah Simmons, M. Sc.anmeldt af Kate Anderton, B.Sc. (redaktør)

Blotting er den proces, hvormed DNA, RNA eller proteiner overføres til en membran for at blive visualiseret.

kredit: Paul Koan/.com

den første af disse metoder var Southern Blotting, udviklet i 1975 af Edvard Southern, og bruges til at detektere sekvensen af DNA-fragmenter. Siden da er der udviklet to andre metoder, kaldet nordlige og vestlige blotting. Dette er processer, der bruges til at identificere henholdsvis RNA og proteinsekvenser.

metode til sydlig blotting

DNA-fragmenter genereres oprindeligt med restriktionsfragmenter og adskilles efter størrelse i en proces kaldet gelelektroforese. Alkalisk bruges derefter til at denaturere det dobbeltstrengede DNA og danne enkeltstrenge. DNA ‘ et overføres derefter til et nitrocellulose-eller nylonark ved at placere en membran over gelen og bruge strømmen af buffer til at tilskynde til bevægelse af DNA fra gelen til membranen.

Kapillærstrøm og vakuumoverførsel er de to mest almindelige metoder, der bruges til at overføre DNA-fragmenterne. I kapillærstrøm placeres gelen over bufferniveauet på en understøtningsblok med en membran placeret ovenpå. En stak absorberende håndklæder placeres derefter over membranen og bruges til at absorbere bufferen under gelen og løfte DNA-fragmenterne op på membranen.

ved hjælp af vakuumoverførsel placeres membranen under gelen, og begge nedsænkes i buffer. Et vakuum bruges derefter til at skabe en strømning, der trækker DNA-fragmenterne ned på membranen.

opvarmning eller UV-stråling bruges derefter til at sikre, at DNA-fragmenterne forbliver fastgjort til membranen permanent, samtidig med at det specifikke arrangement af DNA opretholdes. Enkeltstrengede mærkede prober bruges derefter til at binde til målsekvenser.

arket inkuberes med disse prober, og kun de komplementære prober binder. De ikke-komplementære prober vaskes derefter fra membranen, hvilket sikrer, at kun de bundne prober forbliver. Disse prober kan derefter detekteres ved autoradiografi for at afsløre hybridiseringsmønsteret på en røntgenfilm.

anvendelser af Southern blotting

Southern blotting har mange forskellige anvendelser. For det første kan genomlejringer analyseres. For eksempel kan denne metode i immunologi anvendes til at identificere de klonale omlejringer af T-cellereceptorgener. For det andet kan specifikke fragmenter af DNA identificeres fra en blanding af mange andre fragmenter.

andre eksempler på anvendelser inkluderer både restriktionsfragmentlængde polymorfisme (RFLP) og variabelt antal tandem gentagelse (VNTR) analyse. RFLP bruger forskellene i længde i homologe DNA-sekvenser til at kortlægge genomer og kan bruges i retsmedicinske og faderskabstest.

VNTR-analyse bruger forskellene i længden af gentagne nukleotidsekvenser til at danne et DNA-fingeraftryk, en metode, der ofte bruges i faderskab og retsmedicinsk test.

disse metoder kan også anvendes til diagnosticering af sygdomme forårsaget af mutation, for eksempel seglcelleanæmi. Denne genetiske tilstand skyldes en enkelt nukleotidpolymorfisme (A til T) i beta-globingenet, hvilket resulterer i abnorm hæmoglobin.

sydlige blotting for skrøbeligt syndrom

sydlige blots er blevet brugt i vid udstrækning til at hjælpe med at identificere gener med amplificerede gentagelsesregioner. Dette er korte, gentagne sekvenser i DNA, der ikke koder for genprodukter. Et eksempel, hvor sydlig blotting kan være nyttig, er i diagnosen skrøbeligt K-syndrom. Denne genetiske tilstand skyldes stigningen i CGG / CCG-gentagelsesregionen, som er placeret inden for FMR1-genet.

dette gen indeholder normalt mellem 5-40 gentagelsesregioner. Personer med 55-200 gentagelser har en FMR1 gen premutation, og personer med > 200 gentagelser har skrøbeligt syndrom. Stigningen i gentagelser fører til methylering af genet, som hæmmer transkription og forhindrer produktionen af fmrp-proteinet. Dette protein er nødvendigt for nervesystemets normale funktion, derfor fører tab af proteinfunktion til symptomerne på skrøbeligt HS-syndrom.

ved diagnose anvendes methyleringsfølsom restriktion Eclk1 og Methyleringsfølsom EcoR1 til at tillade differentiering af methylerede alleler og ikke-methylerede alleler. Methylerede alleler skæres kun en gang for at give et enestående DNA-fragment på 5,1 kb.

imidlertid skæres ikke-methylerede alleler to gange og producerer et fragment på 2,8 kb. Ikke-methylerede premutations-gentagelser (<200) kan derfor skelnes fra methylerede mutations-gentagelser på omkring 200 gentagelser lange, da sydlig blotting kan bruges til at identificere størrelserne på DNA-fragmenterne.

fremtidsperspektiver

samlet set er sydlig blotting en vigtig metode til diagnosticering og undersøgelse af sygdom (såsom skrøbeligt HS-syndrom og seglcelleanæmi) og analyse af DNA af andre årsager (såsom retsmedicinsk og faderskabstest).

southern blotting er imidlertid meget teknisk kompleks, dyr, besværlig og kræver en stor mængde DNA-prøve. Nye metoder erstatter derfor langsomt sydlig blotting, for eksempel realtids PCR. Denne proces er meget lettere og hurtigere end sydlig blotting og kræver kun et meget lille volumen DNA.

yderligere læsning

• alt Genetikindhold
• Hvad er genetik?
• historie af genetik
• genetik og genekspression
• genetisk ændring

skrevet af

Hannah Simmons

Hannah er en medicinsk og biovidenskab forfatter med en Master of Science (M.Sc.) grad fra Lancaster University, UK. Før han blev forfatter, fokuserede Hannahs forskning på opdagelsen af biomarkører for Parkinsons og Parkinsons sygdom. Hun arbejdede også for yderligere at belyse de biologiske veje involveret i disse sygdomme. Uden for sit arbejde nyder Hannah at svømme, tage sin hund en tur og rejse verden rundt.

citater