Bile-Esculine Test per l’Identificazione Presuntiva di Enterococchi e Streptococchi: Effetti della Bile, la Concentrazione, la Tecnica di Inoculazione, e Tempo di Incubazione

Riconoscimento e differenziazione di cocchi gram-positivi catalasi-negativi, alfa-emolitici e non emolitici in coppie e catene come enterococchi; streptococchi di gruppo D (mainlyStreptococcus bovis); e streptococchi di gruppo viridani non di gruppo D sono clinicamente importanti (10). Il test bile-esculina è ampiamente utilizzato per differenziare gli enterococchi e gli streptococchi di gruppo D, che sono tolleranti alla bile e possono idrolizzare l’esculina in esculetina, dagli streptococchi del gruppo viridans non di gruppo D, che crescono male sulla bile. Descritto per la prima volta nel 1926 da Meyer e Schonfeld (8), il test della bile-esculina è stato dimostrato da Facklam e Moody (2, 3, 5) per avere una sensibilità del 100% e una specificità del 97% per identificare gli enterococchi e gli streptococchi del gruppo D. Questi risultati sono stati ottenuti con inclinazioni agar contenenti 4% oxgall (sali biliari), inoculate con 1 o 2 gocce di un Todd-Hewitt 24-h entrambe le colture dell’organismo (inoculazione”next-day”) e incubate per 48 h. Nella batteriologia diagnostica di routine, tale protocollo non è pratico, poiché richiede 3 giorni dal momento in cui le colonie vengono rilevate sulle piastre primarie. La maggior parte dei libri di testo e dei manuali di procedura consiglia di inoculare le inclinazioni di agar direttamente da alcune colonie (inoculazione”nello stesso giorno”) piuttosto che da una sottocultura 24-h in brodo, ma mancano dati a supporto di questa tecnica alternativa non standardizzata.

Pertanto, abbiamo valutato la sensibilità e la specificità del test di bile-esculina con due diversi metodi di inoculazione nello stesso giorno (standardizzati e non standardizzati) e due diversi tempi di incubazione (24 e 48 h). Abbiamo anche confrontato esculin slants contenenti 2 e 4% oxgall in formulazioni attualmente disponibili da due importanti fonti commerciali negli Stati Uniti.

Cocchi catalasi-negativi, gram-positivi in coppie e catene che formano colonie alfa-emolitiche o non emolitiche su agar di sangue di pecora 5% positivi per PYR (Murex, Dartford, Regno Unito) e cresciuti in brodo di soia triptico contenente 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) sono stati identificati come enterococchi; sono stati speciati con il sistema API Rapid Strep (bioMérieux Vitek,Hazelwood, Mo.). Cocchi catalasi-negativi, gram-positivi in coppie e catene che formano colonie alfa-emolitiche o non emolitiche che erano negative per PYR, non crescevano nel 6,5% di NaCl, erano positivi per l’antigene del gruppo D mediante agglutinazione al lattice (Murex) e avevano un pattern biochimico suggestivo (≥90% di probabilità) dal sistema API Rapid Strep sono stati identificati come S. bovis. Cocchi catalasi-negativi, gram-positivi in coppie e catene che formano colonie alfa-emolitiche o nonemolitiche negative per l’antigene PYR e del gruppo D (e insolubili nella bile se alfa-emolitico) sono stati chiamati streptococchi del gruppo viridans.

Sono stati testati un totale di 110 ceppi enterococcici (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium e 61 ceppi non emolitici e non specifici), 30 ceppi S. bovis (2 ceppi alfa-emolitici e 28 ceppi non emolitici) e 110 ceppi streptococcici del gruppo viridans non di gruppo D (83 ceppi alfa-emolitici e 27 ceppi non emolitici). I ceppi sono stati isolati consecutivamente da emocolture eseguite presso il Duke University Medical Center durante un periodo di 4 anni, ad eccezione di 19 S. bovisstrains che sono stati ottenuti dalla Mayo Clinic.

Batteri freschi (24-h) sono stati inoculati su tre diverse inclinazioni di agar di esculina contenenti nessuna bile (BDMS), 2% oxgall (equivalente al 20% bile) (BDMS) o 4% oxgall (equivalente al 40% bile) (Remel, Lenexa, Kans.). Ad eccezione di oxgall, le composizioni dei tre media erano le stesse. Per ogni mezzo, sono state utilizzate le seguenti due tecniche di inoculazione: (i) inoculazione diretta, non standardizzata a forma di S di 1-10 colonie e (ii) inoculazione indiretta e standardizzata di 10 µl (anello calibrato) di una sospensione standard di 0,5 McFarland di batteri in acqua deionizzata sterile. Le inclinazioni sono state incubate a 35°C in aria ambiente (2) con tappi sciolti per 48 h. Le letture sono state prese a 24 e 48 h. Una reazione è stata considerata positiva quando metà o più del mezzo è stato annerito (4).

Con una sola eccezione, tutti i 110 ceppi enterococcici hanno dato reazioni positive evidenti dopo 24 e 48 ore di incubazione (sensibilità al 99%). L’inoculo standardizzato (circa 106 CFU) era sensibile quanto l’inoculo più pesante e non standardizzato. Facklam e Moody, utilizzando un inoculo da 107 a 108 CFU su agar slants, hanno riportato una sensibilità del 100% a 48 h ma hanno trovato 2 di 76 (5) e 6 di 157 (3) ceppi enterococcici negativi alla bile-esculina (98% di sensibilità) dopo 24 h di incubazione. Swan (13), utilizzando un inoculo non standardizzato descritto come piastre pesanti e agar su cui qualsiasi annerimento è stato considerato un risultato positivo, ha ottenuto una sensibilità del 100% a 24 h con 121 ceppi enterococcici. Tuttavia, sulla base delle pubblicazioni di Facklam, la maggior parte dei libri di testo e dei manuali di procedura consiglia l’incubazione per 48 h prima di riportare un risultato negativo.

Tutti i 30 ceppi di S. bovis sono risultati positivi a 24 e 48 h indipendentemente dalla concentrazione biliare o dal metodo di inoculazione (sensibilità al 100%). Facklam (3) ha riportato una sensibilità del 94 e del 100% a 24 e 48 h, rispettivamente, con 37 ceppi streptococcici del gruppo D.

La tabella 1 riporta le percentuali dei test di bile-esculina falsi positivi per 110 ceppi di streptococco del gruppo viridans non appartenenti al gruppo D. Abbiamo scoperto che la specificità (100% meno la percentuale di falsi positivi) era massima (97%) con un inoculo standardizzato striato su inclinazioni agar contenenti 4% oxgall e letto dopo 24 h. Falsi positivi sono stati ottenuti con due Streptococcus milleriand uno Streptococcus lactis subsp. diacetilattistreni. La mancanza di standardizzazione dell’inoculo, la diminuzione della concentrazione di oxgall al 2% e il prolungamento del tempo di incubazione a 48 h hanno aumentato il numero di falsi positivi fino a un massimo del 24%. In studi precedenti con un agar selettivo di esculina contenente sodio azide e solo il 10% di bile, sono state comuni reazioni positive con streptococchi del gruppo viridans non di gruppo D (6, 11, 12). In precedenza non sono stati pubblicati dati sull’uso di un supporto contenente il 2% di oxgall. I nostri risultati suggeriscono che questa concentrazione è subottimale. Usando 4% oxgall, Swan (13) ha trovato due ceppi streptococcici del gruppo viridans tolleranti alla bile su 21 isolati; nessuno dei due ceppi, tuttavia, ha idrolizzato l’esculina a 24 h. Facklam et al. specificità segnalate del 99% a 24 ore (3) e dall ‘ 81 (4) al 97% (3) a 48 ore con il 4% di oxgall.

Una differenza notevole è stata trovata quando i sottogruppi di streptococchi del gruppo viridans non gruppo D alfa-emolitici e non emolitici sono stati confrontati per il numero di falsi positivi. Per i ceppi alfa-emolitici, questo numero era 0% dopo 24 ore e 3% dopo 48 ore, mentre per i ceppi non emolitici era 11% dopo 24 ore e 33% dopo 48 ore, con 4% oxgall e un inoculo standardizzato (P = 0,017 per i valori di 24 ore; test esatto di Fisher a due code). Tale osservazione non è stata riportata in precedenza.

Per campioni diversi dal sangue e siti normalmente sterili, un diagramma di flusso basato sul test della bile-esculina combinato con una tolleranza al 6,5% di NaCl o presenza di PYR è sufficiente per un’identificazione affidabile degli enterococchi. Gli organismi bile-esculin-positivi da sangue e siti normalmente sterili dovrebbero essere speciati. La speciazione degli enterococchi è utile per ragioni epidemiologiche e perché E. faecium e altre specie tendono ad essere più resistenti agli antibiotici rispetto a E. faecalis (8, 9). Un’identificazione definitiva OFS. bovis è importante, poiché l’organismo è associato a carcinoma del colon, che deve essere escluso in questi pazienti (7). D’altra parte, i rapporti falsi positivi OFS. bovis può portare a indagini non necessarie. La speciazione di organismi bile-esculin-positivi consentirà anche il rilevamento di streptococchi di gruppo viridani falsi positivi non di gruppo D. Errori terapeutici possono verificarsi con errata identificazione di streptococchi e enterococchi (1). La speciazione di routine degli organismi bile-esculina-negativi non è necessaria, poiché gli enterococchi e gli streptococchi del gruppo D raramente danno reazioni false-negative.

In conclusione, la bile esculine test funziona bene per la rapida separata enterococchi e streptococchi di gruppo D non-gruppo D streptococchi del gruppo viridans a basso costo e con una buona sensibilità (>99%) e specificità (97%), purché sia eseguito su agar inclinazioni contenente il 40% di bile, fatto con un standardizzate inoculo (10 µl di 0,5 McFarland standard della sospensione batterica), e la lettura a 24 h.