Biologia cellulare 06: Il citoscheletro Parte II: Tubulina

Queste sono note della lezione 6 del corso di biologia cellulare di Harvard Extension.

La scorsa settimana abbiamo coperto i microfilamenti, che sono fatti di actina. Questa settimana: microtubuli, fatti di tubulina. Perché, chiedi, il citoscheletro ha bisogno di due sistemi separati? Considera che i microfilamenti sono solo catene di singole subunità, mentre i microtubuli sono letteralmente tubi (come vedremo a breve) – cilindri cavi con pareti fatte di catene fatte di dimeri. Queste diverse strutture significano diverse capacità: i microfilamenti possono più facilmente formarsi spontaneamente e possono ramificarsi (con l’aiuto di Arp2/3 e altri complessi discussi l’ultima volta) per formare diverse forme di rete e collegare diverse parti della cellula. I microtubuli si basano più pesantemente sulla nucleazione per formarsi e sono fondamentalmente una rete a raggi che collega il centrosoma alla periferia della cellula. In pratica, i microfilamenti sono abbondanti nella corteccia cellulare e fortemente coinvolti nei movimenti contrattili e nella motilità cellulare, mentre i microtubuli sono più coinvolti nell’organizzazione degli organelli e fungono da tracce per il trasporto anterograde e retrogrado.

Microtubuli

(Immagine grazie a Wikimedia Commons utente Jeffrey81)

Oltre a Wikipedia, le precedenti edizioni dei libri di testo di biologia cellulare Lodish e Cooper disponibili su NCBI sono anche ottimi riferimenti.

La struttura tubolare dei microtubuli è più robusta dei microfilamenti, consentendo molta trazione e spinta per impieghi gravosi. Anche se robusti, i microtubuli dipendono dalla temperatura: depolimerizzano se raffreddati a 4°C e si ripolimerizzano nuovamente se riscaldati a 37°C a condizione che GTP sia disponibile.

Il blocco di base dei microtubuli è un dimero α-tubuilina/β-tubulina (codificato rispettivamente dai geni TUBA_ e dai geni TUBB_). Le singole proteine della tubulina pesano ciascuna ~55kDa, quindi a ~110Da / aminoacido che è dell’ordine di 500 aminoacidi. Sia α-che β-tubulina legano il GTP, ma α praticamente lo tiene per sempre, mentre in β può essere scambiato o idrolizzato in GDP e quindi scambiato di nuovo con il nuovo GTP.

Fili di dimeri α/β consecutivi costituiscono protofilamenti e 13 protofilamenti disposti fianco a fianco in un cilindro formano un microtubulo. Lo spazio tra i protofilamenti è chiamato “cucitura”. L’intero microtubulo ha un diametro di ~25 nm. Puoi vedere la sua struttura (fatta di dimeri e protofilamenti) nella vita interiore del segmento cellulare sui microtubuli:

All’interno di ogni dimero, la subunità β è l’estremità ( + ), favorita per la polimerizzazione e l’α è l’estremità ( – ), favorita per la depolimerizzazione. I microtubuli si formano fondamentalmente negli stessi tre passaggi dei microfilamenti: nucleazione, allungamento e stato stazionario. Ma a differenza dei microfilamenti non si nucleano facilmente da soli, quindi la nucleazione richiede centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Le cellule non divisorie hanno ciascuna solo un MTOC, chiamato centrosoma. (Questo è anche raffigurato nel video qui sopra). Situato vicino al nucleo, il centrosoma è hub ad una configuation radiale dei microtubuli con ( – ) le estremità appuntite dentro e ( + ) le estremità che puntano alla periferia della cellula.

Il centrosoma è composto da 2 cilindri chiamati centrioli. Ogni centriolo è costituito da ciascuna serie 9 di 3 microtubuli fusi lateralmente, circondati da un “materiale pericentriolare” amorfo ricco di cose che promuovono la nucleazione – in particolare i complessi ad anello γ-tubulina (la tubulina gamma è codificata dai geni TUBG_). γ-tubulin è pensato come “rondella spaccata”:

Il modello è che le doppie punte permettono alla γ-tubulina di legarsi alla α-tubulina-cioè l’estremità (-) di un microtubulo da formare-fornendo il seme di nucleazione per la formazione di un microtubulo.

I microtubuli possono essere formati in vitro. Le dinamiche dipendono principalmente da concentrazioni critiche. L’estremità ( – ) è meno inclinata verso la polimerizzazione rispetto all’estremità ( + ), quindi ha una concentrazione critica più elevata. Se la concentrazione effettiva è tra le concentrazioni critiche delle due estremità, si verifica il tapis roulant.

Quando un microtubulo inizia improvvisamente a dissociarsi questo è chiamato una ‘catastrofe’. Le catastrofi hanno alcune dinamiche energetiche interessanti. Ricordiamo da prima che la beta-tubulina, che è l’estremità (+) in cui avviene l’allungamento, può essere legata al GTP o al PIL. È una parte più stabile del suo microtubulo quando è legato al GTP; la tubulina legata al PIL è suscettibile di dissociarsi. I microtubuli si formano principalmente per aggiunta di beta-tubulina legata al GTP all’estremità ( + ), ma dopo essere state aggiunte, le molecole di beta-tubulina successivamente idrolizzano il loro GTP, lasciandole legate al PIL. Quindi c’è una sorta di “punta” del microtubulo che è legato al GTP, mentre la beta-tubulina più in basso nel microtubulo, aggiunta più a lungo, è legata al PIL. Se la frontiera dell’idrolisi GTP raggiunge la punta, o se succede qualcosa per recidere il microtubulo, allora la beta-tubulina meno stabile legata al PIL diventa esposta e i protofilamenti inizieranno a staccarsi come “corna di ariete”. Se ciò accade, il microtubulo si disassemblerà finché non colpirà una” isola ” di beta-tubulina legata al GTP da qualche parte più in basso nella paglia. La catastrofe può essere ‘salvata’ con l’aggiunta di nuovi dimeri di tubulina legati al GTP che copriranno le estremità e stabilizzeranno i protofilamenti, consentendo al microtubulo di riformarsi. Puoi vedere in questo video che la depolimerizzazione dei microtubuli può essere molto più veloce della polimerizzazione:

Ecco alcuni composti utili per studiare i microtubuli. La colchicina, un farmaco anti-gotta, lega i dimeri alfa-beta liberi, riducendo il loro apporto per la formazione di microtubuli e promuovendo così la depolimerizzazione. Nocodazole inoltre interferisce con la nuova formazione dei microtubuli e poiché la formazione di nuovi microtubuli è importante per la mitosi, nocodazole è una droga antineoplastica del cancro. Al contrario, paclitaxel (taxol), un altro farmaco anti-cancro, funziona stabilizzando i microtubuli, poiché la rottura dei microtubuli esistenti è importante anche per la mitosi.

Le proteine associate ai microtubuli (MAPPE) hanno vari ruoli. Degni di nota sono MAP4 (nelle cellule non neuronali), MAP2 (nei neuroni) e Tau (nei neuroni; codificato dal gene MAPT). Tutti questi hanno in comune che agiscono per stabilizzare i microtubuli, spostando la cinetica a favore della crescita dei microtubuli e contro la catastrofe. Ciascuno contiene un tratto di 18 aminoacidi con aminoacidi caricati positivamente che si legano alla parte negativa dei microtubuli. Possono agire per raggruppare più microtubuli insieme , con MAP2 che tiene i microtubuli a una distanza maggiore a causa del suo braccio più lungo (rispetto a Tau).

Le MAPPE sono regolate dalla fosforilazione: le chinasi proteiche MARK legano covalentemente i gruppi fosfato agli amminoacidi S, T o Y nelle proteine MAP, riducendo la loro capacità di legare i microtubuli. (Le chinasi dipendenti dalla ciclina regolano anche le MAPPE durante la mitosi). Si pensa che queste MAPPE agiscano per determinare la struttura fisica delle cellule. Nei neuroni, MAP2 si trova nei dendriti e Tau è principalmente nell’assone. Mutazioni nel gene MAPT che codifica per Tau causano demenza frontotemporale (FTD). Il Tau iperfosforilato si trova (anche se non sappiamo perché) nel cervello dei pazienti di Alzheimer. I modelli murini di entrambe queste malattie mostrano una degenerazione assonale, coerente con il fatto che Tau non è in grado di svolgere il suo lavoro di stabilizzazione dei microtubuli nell’assone.

Un’altra classe di proteine, denominata +Tips per il loro legame con l’estremità (+) dei microtubuli, può proteggere dalla catastrofe. Sembrano estendere un modo giusto giù nel microtubulo. Questo video mostra che EB-1 viene spinto verso l’esterno perché le estremità dei microtubuli stanno crescendo:

Altre proteine che legano l’estremità promuovono la catastrofe piuttosto che la stabilità. Kinesin-13 agisce per curvare la fine dei protofilamenti, abbassando la soglia per la catastrofe. Stathmin (gene STMN1; aka Op18, dove Op sta per oncoproteina) si lega ai dimeri di tubulina all’interno di un protofilamento, promuovendo sia la catastrofe immediata che possibilmente anche l’idrolisi del GTP, che rimuovendo “isole” di beta-tubulina legata al GTP rappresenterebbe più di un investimento a lungo termine a favore della catastrofe. Stathmin è regolato dalla fosforilazione. Katanin (dopo la spada giapponese katana) recide letteralmente i microtubuli.

Le proteine motorie dei microtubuli sono in gran parte simili alle proteine motorie dei microfilamenti. Vengono in due famiglie: chinesine, la maggior parte delle quali si muovono anterograde cioè verso la fine ( + ); e dyneins, la maggior parte delle quali si muovono retrograda cioè verso la fine ( -). “Camminano” in questo modo:

La chinesina e la dineina sono coinvolte negli organelli in movimento, nell’endocitosi e nell’esocitosi e nella segregazione cromosomica durante la meiosi & mitosi.

La chinesina-1, la più studiata delle chinesine, è una chinesina “convenzionale” in quanto funziona come un tetramero composto da due unità a catena pesante (geni KIF1, ad es. KIF1A) che comprendono i domini “testa” che idrolizzano l’ATP e legano i microtubuli e due unità a catena leggera (geni KLC, ad esempio KLC1) che comprendono una “coda” che lega il carico, in questo caso vescicole. Un dominio linker (di quale proteina è questa parte?) consente la dimerizzazione di due catene pesanti.

Ecco un video di esso in azione. Si noti che il video lo chiama un dimero invece di un tetramero; Penso che sia perché stanno solo considerando le teste e non discutendo le code.

Alcune delle altre chinesine differiscono un po’:

• Kinesin-2, che fa anche vescicola & trasporto organello, è un eterotrimero con due diverse (anche se correlate) catene pesanti e un altro polipeptide che utilizza per regolare il suo carico.
• Kinesin-5 ha teste ad entrambe le estremità invece di una testa e una coda, in modo che cammini in direzioni opposte su due diversi microtubuli, tirandoli insieme. Questo è chiamato ‘movimento bipolare’.
• La chinesina-14 è l’unica chinesina conosciuta che si muove verso l’estremità (-) ed è coinvolta nella mitosi.

I principi del movimento “a piedi” sono praticamente gli stessi per tutte le kinesine, tuttavia, e sono ciò che è raffigurato nell’ultimo video qui sopra. Quando non sono legati a un microtubulo, le “teste” sono entrambe legate ADP. Una testa capiterà di incontrare un microtubulo e si legherà ad esso, rilasciando il suo ADP, consentendo a un ATP di sostituirlo. Il legame ATP induce un cambiamento conformazionale che tira sul linker, oscillando l’altro, “ritardando” la testa in avanti nella posizione di leader dove si lega al microtubulo. La testa originale idrolizza quindi l’ATP che rilascia il fosfato (che è abbreviato come Pi nel video) e fornisce l’energia per l’unico passo energeticamente in salita in questo processo, che si sta staccando dal microtubulo.

La miosina (la proteina motoria che cammina sui microfilamenti) e la chinesina hanno strutture molto simili ma nessuna somiglianza di sequenza aminoacidica. Quindi si ritiene che non siano paralog, ma piuttosto un esempio di evoluzione convergente.

Le persone parlano molto delle chinesine in parte perché non capiamo altrettanto bene le dyneine. Le dyneine sono proteine enormi, fatte di 2 grandi, 2 intermedie e 2 piccole subunità. La loro vastità li ha resi difficili da isolare e caratterizzare e il loro funzionamento non è ben compreso. Sappiamo che il complesso della dynactina (un complesso multi-proteico; le dinattine stesse sono i geni DTCN_) è coinvolto come un ‘adattatore’ che collega la dynein al carico.

Questo video riassume l’intero citoscheletro e le corde in gran parte del materiale della scorsa settimana e di questa conferenza:

PrP

Come menzionato nelle note della via secretoria, il PrP è ancorato al GPI alla membrana e subisce l’endocitosi molto regolarmente, creando vescicole endocitiche con PrP in esse. Encalada 2011 rileva che Kinesin-1C e DHC1 (dynein heavy chain 1) sono responsabili del trasporto di queste vescicole PrP anterograde e retrograde rispettivamente. Quando Encalada ha eliminato, abbattuto o inibito Kinesin-1C, il movimento anterograde e retrogrado è stato ridotto e allo stesso modo quando DHC1 è stato interrotto. Quindi sembra che questi due complessi, sebbene si muovano in direzioni opposte, si attivino l’un l’altro. E, curiosamente, interrompere queste proteine motorie non ha impedito alle vescicole PrP di associarsi ai motori – semplicemente non si muovevano così velocemente o più spesso. Il documento ha una serie di altre conclusioni sulla biologia cellulare sulla natura di come le vescicole attivano le proteine motorie e su come viene determinata la direzione del trasporto.