Che cosa è Southern Blotting?

Di Hannah Simmons, M. Sc.Recensito da Kate Anderton, B.Sc. (Editor)

Il blotting è il processo mediante il quale DNA, RNA o proteine vengono trasferiti su una membrana per essere visualizzati.

Credito: Paul Cowan/. com

Il primo di questi metodi era Southern Blotting, sviluppato nel 1975 da Edward Southern, e viene utilizzato per rilevare la sequenza di frammenti di DNA. Da allora, sono stati sviluppati altri due metodi, chiamati Northern e Western blotting. Questi sono processi che vengono utilizzati per identificare le sequenze di RNA e proteine, rispettivamente.

Metodologia del Southern blotting

I frammenti di DNA sono inizialmente generati con enzimi di restrizione e separati per dimensione in un processo chiamato elettroforesi su gel. L’alcalina viene quindi utilizzata per denaturare il DNA a doppio filamento, formando singoli filamenti. Il DNA viene quindi trasferito su un foglio di nitrocellulosa o nylon posizionando una membrana sopra il gel e utilizzando il flusso di tampone per incoraggiare il movimento del DNA dal gel alla membrana.

Il flusso capillare e il trasferimento del vuoto sono i due metodi più comuni utilizzati per trasferire i frammenti di DNA. Nel flusso capillare, il gel viene posizionato sopra il livello del tampone su un blocco di supporto con una membrana posta sopra. Una pila di asciugamani assorbenti vengono quindi posizionati sopra la membrana e vengono utilizzati per assorbire il buffer da sotto il gel, sollevando i frammenti di DNA sulla membrana.

Utilizzando il trasferimento sotto vuoto, la membrana viene posizionata sotto il gel ed entrambe sono immerse nel buffer. Un vuoto viene quindi utilizzato per creare un flusso che tira i frammenti di DNA verso il basso sulla membrana.

Il riscaldamento o la radiazione UV vengono quindi utilizzati per garantire che i frammenti di DNA rimangano attaccati alla membrana in modo permanente, pur mantenendo la disposizione specifica del DNA. Le sonde etichettate a filamento singolo vengono quindi utilizzate per legarsi alle sequenze target.

Il foglio viene incubato con queste sonde e solo le sonde complementari si legano. Le sonde non complementari vengono quindi lavate dalla membrana, assicurando che rimangano solo le sonde legate. Queste sonde possono quindi essere rilevate dall’autoradiografia per rivelare il modello di ibridazione su una pellicola a raggi X.

Applicazioni di Southern blotting

Southern blotting ha molti usi diversi. In primo luogo, è possibile analizzare i riarrangiamenti genici. Ad esempio, in immunologia questo metodo può essere utilizzato per identificare i riarrangiamenti clonali dei geni del recettore delle cellule T. In secondo luogo, frammenti specifici di DNA possono essere identificati all’interno di una miscela di molti altri frammenti.

Altri esempi di utilizzo includono sia l’analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) che l’analisi del numero variabile tandem repeat (VNTR). RFLP utilizza le differenze di lunghezza nelle sequenze di DNA omologhe per mappare i genomi e può essere utilizzato nei test forensi e di paternità.

L’analisi VNTR utilizza le differenze di lunghezza delle sequenze nucleotidiche ripetute per formare un’impronta digitale del DNA, un metodo comunemente usato nei test di paternità e forense.

Questi metodi possono essere utilizzati anche nella diagnosi di malattie causate da mutazioni, ad esempio anemia falciforme. Questa condizione genetica è dovuta ad un singolo polimorfismo nucleotidico (da A a T) nel gene della beta-globina, con conseguente emoglobina anomala.

Southern blotting per la sindrome X fragile

Southern blots sono stati ampiamente utilizzati per aiutare a identificare i geni con regioni ripetitive amplificate. Si tratta di sequenze brevi e ripetitive nel DNA che non codificano i prodotti genici. Un esempio in cui southern blotting può essere utile è nella diagnosi della sindrome X fragile. Questa condizione genetica è dovuta all’aumento della regione di ripetizione CGG/CCG che si trova all’interno del gene FMR1.

Questo gene di solito contiene tra 5-40 regioni ripetute. Gli individui con 55-200 ripetizioni hanno una premutazione del gene FMR1 e gli individui con > 200 ripetizioni hanno la sindrome X fragile. L’aumento delle ripetizioni porta alla metilazione del gene, che inibisce la trascrizione e impedisce la produzione della proteina FMRP. Questa proteina è necessaria per la normale funzione del sistema nervoso, quindi la perdita della funzione proteica porta ai sintomi della sindrome X fragile.

Nella diagnosi, l’enzima di restrizione sensibile alla metilazione EclX1 e l’enzima insensibile alla metilazione EcoR1 sono utilizzati per consentire la differenziazione degli alleli metilati e degli alleli non metilati. Gli alleli metilati vengono tagliati solo una volta per dare un frammento di DNA singolare di 5,1 kb.

Tuttavia gli alleli non metilati vengono tagliati due volte, producendo un frammento di 2,8 kb. Le ripetizioni di premutazione non metilate (<200) possono quindi essere distinte dalle ripetizioni di mutazione metilate di circa 200 ripetizioni lunghe, poiché il southern blotting può essere utilizzato per identificare le dimensioni dei frammenti di DNA.

Prospettive future

Nel complesso, Southern blotting è un metodo importante nella diagnosi e nello studio di malattie (come la sindrome dell’X fragile e l’anemia falciforme) e nell’analisi del DNA per altri motivi (come i test forensi e di paternità).

Tuttavia, southern blotting è molto tecnicamente complesso, costoso, laborioso e richiede una grande quantità di campione di DNA. I nuovi metodi stanno quindi lentamente sostituendo southern blotting, ad esempio la PCR in tempo reale. Questo processo è molto più facile e veloce di southern blotting e richiede solo un volume molto piccolo di DNA.

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Scritto da

Hannah Simmons

Hannah è un medico e scienze della vita e scrittore con un Master of Science (M. Sc.) laurea presso l’Università di Lancaster, regno UNITO. Prima di diventare una scrittrice, la ricerca di Hannah si è concentrata sulla scoperta di biomarcatori per la malattia di Alzheimer e Parkinson. Ha anche lavorato per chiarire ulteriormente i percorsi biologici coinvolti in queste malattie. Al di fuori del suo lavoro, Hannah ama nuotare, portare il suo cane a fare una passeggiata e viaggiare per il mondo.

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