Confronto della tossicità dei diazinoni con le specie di dafnia temperate e tropicali d’acqua dolce
Abstract
La presenza di pesticidi nei corpi idrici presenta sfide uniche per l’ecosistema e tutte le forme di vita. I metodi biologici sono stati ampiamente utilizzati per esaminare gli effetti tossici di varie sostanze tossiche, compresi i pesticidi. Il presente studio mira a determinare gli effetti avversi del diazinon, un insetticida organofosfato non sistemico, su due specie di cladoceran tra cui la Daphnia magna temperata (D. magna) e la Daphnia lumholtzi tropicale (D. lumholtzi). I valori di 48 h LC50 hanno dimostrato una maggiore tossicità di diazinon per D. lumholtzi ad una concentrazione di 3,41 µg·L−1 rispetto a D. magna ad una concentrazione di 4,63 µg * L−1. Dopo 14 giorni di esposizione a diazinon, la capacità di sopravvivenza e il potenziale di riproduzione delle due specie di cladoceran si sono chiaramente ridotti e il loro tasso di aumento della popolazione (RPI) è diminuito a concentrazioni >0,1 µg·L−1. Il presente studio ha indicato che il cladocerano tropicale (D. lumholtzi) era più sensibile del temperato D. magna. Pertanto, potrebbe essere utilizzato come indicatore per la valutazione della tossicità in ambienti tropicali. La presenza di diazinon nei corpi idrici può essere associata a un rischio significativo per gli organismi acquatici.
1. Introduzione
Negli ultimi decenni, la maggior parte dei paesi sviluppati si sta spostando verso un’agricoltura priva di sostanze chimiche, nota anche come agricoltura/agricoltura “biologica”, o in altre parole, diminuendo l’uso di pesticidi . Ciò ha comportato miglioramenti sostanziali nelle pratiche agronomiche guidate da normative rigorose e nella qualità dei corpi idrici naturali, cioè meno rischi per le vite acquatiche . La maggior parte dei paesi in via di sviluppo nelle regioni tropicali stanno aumentando il loro uso di pesticidi e fertilizzanti man mano che diventano più ricchi . Di conseguenza, la concentrazione di pesticidi negli ambienti tropicali è costantemente aumentata, causando un calo della diversità delle specie. Sebbene i pesticidi abbiano alcuni effetti benefici per le colture agricole, il loro uso può causare una vasta gamma di effetti tossici su diversi organismi non bersaglio .
Il diazinone (O, O-dietil – O-fosforotioato) è un insetticida organofosfato non sistematico. È stato comunemente usato per il controllo dell’inserto nelle colture agricole . La tossicità di diazinon deriva dall’inibizione dell’enzima acetilcolinesterasi (AChE), che porta all’accumulo di neurotrasmettitori e all’alterazione della trasmissione del segnale nelle sinapsi chimiche . Nei mercati nazionali e internazionali, ci sono più di 500 prodotti registrati che contengono diazinon come principio attivo . A causa del suo uso diffuso, il diazinon si trova spesso negli ecosistemi di acqua dolce . In un recente studio, Montuori et al. ha riferito che il diazinon è prevalente nei sistemi acquatici in tutta Europa, con la più alta concentrazione registrata per essere 785 ng·L−1 nel fiume Ebro, in Spagna. Inoltre, alte concentrazioni di diazinon fino a 1,5 µg·L−1 sono state trovate nei corsi d’acqua urbani in California . Negli ultimi decenni, il diazinon è stato ampiamente utilizzato nelle regioni tropicali . Tuttavia, le leggi e i regolamenti sui pesticidi non sono stati attuati adeguatamente in queste regioni nonostante le loro pesanti applicazioni. Gli effetti tossici del diazinon sono disponibili in letteratura per il cladoceran temperato D. magna. Tuttavia, gli effetti tossici di diazinon sugli zooplancton tropicali non sono stati ben documentati e studiati in letteratura.
Il diazinon genera un’elevata tossicità acuta per un’ampia varietà di organismi acquatici, causando una vasta gamma di effetti biochimici subletali, danni a specifici organi e tessuti bersaglio e impatti ecologici avversi. La tossicità di diazinon è stata ampiamente studiata nei pesci e nei crostacei ed è stata segnalata come moderatamente tossica per le prime fasi di vita del pesce zebra . I valori di 96 h LC50 che vanno da 0,32 a 1,53 mg·L−1 per la larvale e da 2,2 a 10,3 mg * L−1 per l’adulto di diversi pesci sono già stati registrati . Yen et al. ha riferito che diazinon abbassa l’attività di nuoto larvale e inibisce l’attività AChE in zebrafish, così come un aumento del contenuto di Hsp70. In cladocerans, diazinon alla concentrazione da 0.18 a 0.30 µg * L-1 ha causato effetti sfavorevoli sulla sopravvivenza di D. magna . Queste concentrazioni di diazinon sono state riportate per causare una diminuzione dei giovani totali medi per femmina, delle dimensioni medie della covata e del tasso di aumento della popolazione (RPI) e dello sviluppo di D. magna. Solo la concentrazione superiore a 0,25 µg * L-1 ha causato un ritardo nel tempo alla prima riproduzione . I modelli tossicocinetici e tossicodinamici di diazinon e del suo sottoprodotto 2-isopropil-6-metil-4-pirimidinolo nelle specie di crostacei sono stati studiati da Kretschmann et al. . I risultati hanno suggerito che la dearilazione ossidativa di diazinon a pirimidinolo è una fase cruciale di disintossicazione cellulare che è catalizzata dall’enzima P450 . Tuttavia, la maggior parte degli studi ecotossicologici utilizza il cladoceran temperato D. magna come modello ecotossicologico; la tossicità dell’insetticida sulle specie zooplancton tropicali non è stata esaminata nella stessa misura .
In questo studio, sono stati eseguiti un test acuto di 48 ore e un test cronico di 14 giorni per studiare gli effetti di diazinon su due specie di cladoceran. La tossicità di diazinon alle prime fasi di vita della specie temperata D. magna è stato testato e la tossicità su D. magna è stata confrontata con quella sulla specie tropicale D. lumholtzi. I risultati forniranno informazioni di base per stabilire il punto di riferimento per gli insetticidi organofosfati nelle acque tropicali.
2. Materiali e metodi
2.1. Chemicals
Diazinon (O,O-dietil-O – fosforotioato) è stato acquistato da Sigma-Aldrich. Le soluzioni madre di 1 mm sono state preparate diluendo in dimetilsolfossido (DMSO) prima dell’esperimento e mantenute a 4°C.
2.2. Organismi di prova
Nel presente studio sono state utilizzate due specie di cladocerans: D. lumholtzi è stato isolato da uno stagno di pesci nel nord del Vietnam. D. magna è stato ottenuto da MicroBioTest Inc. (Belgio). Entrambi i dafnidi sono stati coltivati in becher 1 L riempiti con mezzo COMBINATO e mantenuti a una temperatura di 25 ± 1°C sotto un ciclo chiaro: scuro di 12 h: 12 h. Gli animali sono stati nutriti con alga microgreen (Chlorella sp.) e una miscela 1 : 1 : 1 di lievito, cerrofilo, e trota chow digestione (YTC) . Il mezzo alimentare e culturale sono stati rinnovati ogni due giorni.
2.3. Saggio di tossicità acuta
Il test di immobilizzazione acuta è stato eseguito secondo il protocollo 202 dell’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico . Questo saggio è stato eseguito per valutare la sensibilità della specie e per stabilire l’intervallo di concentrazioni da utilizzare nei saggi cronici. In breve, i neonati di daphnia (di età<24 h) sono stati mantenuti in becher da 50 ml contenenti un mezzo COMBINATO da 30 ml a spillo con diazinone ad un intervallo di concentrazione di 0, 0.5, 1, 2, 5, e 10 µg * L-1. In ciascuna concentrazione di esposizione, sono stati esposti 15 neonati per concentrazione di diazinon e controllo in bianco. Tutte le esposizioni di prova sono state preparate in triplice copia. I contenitori di prova sono stati posti a una temperatura controllata di 25 ± 1°C sotto un ciclo luce : buio di 14 h : 10 h durante 48 h di incubazione. La risposta valutata per questo saggio è stata l’immobilità o la morte dei cladocerani. Il criterio per l’accettazione del test era un tasso di sopravvivenza maggiore o uguale al 90% nel gruppo di controllo. Infine, i dati di mortalità registrati al termine dei test di tossicità (48 h) sono stati utilizzati per determinare la concentrazione letale mediana (48 h LC50).
2.4. Test di tossicità cronica
Sulla base dei risultati di tossicità acuta e delle concentrazioni di diazinone rilevanti per l’ambiente in studi precedenti, i dafnidi sono stati esposti per 14 giorni alle seguenti concentrazioni di diazinone subletale: 0 (controllo), 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, e 1,0 µg * L-1. Il test di riproduzione è stato condotto secondo il protocollo standard descritto in APHA con piccole modifiche. In breve, i neonati di età inferiore a 24 ore sono stati incubati individualmente in becher da 50 ml contenenti un mezzo di controllo da 20 ml o esposti a concentrazioni di diazinone. Concentrazioni di Diazinon e cibo (una miscela di alghe verdi Chlorella sp., ad una densità di 5 × 106 celle * mL-1 e YTC) sono state rinnovate ogni due giorni. La sopravvivenza, la riproduzione (fecondità), il tempo per la prima riproduzione, il numero totale di neonati per femmina, il numero di covate e la dimensione della covata sono stati registrati giornalmente. La lunghezza corporea dei dafnidi genitori è stata misurata alla fine dell’esperimento.
2.5. Analisi statistica
Le concentrazioni letali mediane di 48 h (48 h LC50) sono state previste dall’analisi probit come precedentemente riportato da Stephan . Il tasso di aumento della popolazione (RPI) è stato calcolato secondo il metodo suggerito da Eulero–Lotka : ∑e-rxlxmx = 1, dove lx = la proporzione di sopravvivere all’età x, mx = fecondità specifica dell’età e x = tempo in giorni. Tutti i calcoli erano basati su esperimenti di 14 giorni . Le differenze tra gruppi di trattamento e controlli sono state determinate attraverso l’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Differenze significative () sono state distinte utilizzando il metodo di test di Dunnet. Tutti i dati sono presentati come mediana ± DS.
3. Risultati e discussione
3.1. Tossicità acuta
Non si è verificata mortalità nel controllo durante il tempo sperimentale del test acuto. La più alta concentrazione testata di diazinon ha determinato una mortalità del 100% di entrambi i dafnidi. Tuttavia, diazinon ha mostrato una maggiore tossicità per D. lumholtzi. I valori di 48 h LC50 di diazinon per D. magna e D. lumholtzi nelle condizioni sperimentali testate, con intervallo di confidenza del 95%, erano 4,63 e 3.41 µg * L-1, rispettivamente.
Gli effetti tossici dei pesticidi sugli organismi acquatici sono spesso studiati utilizzando il temperato D. magna in condizioni di laboratorio. Tuttavia, c’è ancora poca comprensione circa gli effetti acuti e cronici di diazinon sui crostacei, particolarmente alle specie che hanno originato dalle regioni tropicali. I valori di 48 h LC50 di diazinon riportati in questo studio erano nell’intervallo con i valori di 48 h LC50 riportati per nauplius di copepod Eodiaptomus (48 h LC50 = 2,8 µg.L-1), Mesociclope (48 h LC50 = 2,9 µg * L−1) e Termociclope (48 h LC50 = 4.1 µg * L−1). Tuttavia, i valori erano inferiori ai valori di 48 h LC50 per gli adulti di Eodiaptomus (48 h LC50 = 46,8 µg·L−1), Mesociclops (48 h LC50 = 30,6 µg·L−1) e Thermocyclops (48 h LC50 = 40,2 µg·L−1), o superiori ai valori di 48 h LC50 per altri cladocerani come Ceriodaphnia dubia (48 h LC50 = 0,21 µg·L−1) . I risultati delle analisi acute hanno documentato una maggiore sensibilità dei neonati tropicali di D. lumholtzi al diazinone rispetto al temperato D. magna. Dal punto di vista dell’applicazione pratica, questi risultati hanno mostrato chiaramente che il D. lumholtzi può servire come surrogato adatto per la specie temperata D. magna, cioè come specie di indicatore di tossicità, in condizioni tropicali.
3.2. Tossicità cronica
Gli effetti delle concentrazioni di diazinone subletale sulla sopravvivenza e sulla riproduzione di D. magna e D. lumholtzi durante i 14 giorni di incubazione sono mostrati nella Tabella 1 e nella Figura 1. La sopravvivenza di entrambi i dafnidi è diminuita con l’aumento delle concentrazioni di diazinon durante il test di 14 giorni. Per D. magna e D. lumholtzi quando esposti al diazinone sono state osservate riduzioni significative delle risposte anamnestiche. Entrambi i dafnidi sono cresciuti bene nell’incubazione di controllo (la lunghezza di D. magna e D. lumholtzi è aumentata fino a 4,1 e 2,4 mm, rispettivamente, alla fine dell’esperimento). Tutti gli individui del controllo sono sopravvissuti per tutto il periodo sperimentale (14 giorni) e hanno prodotto numerosi figli (27,4 ± 3,6 giovani per D. magna e 18,2 ± 2,1 per D. lumholtzi).
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Nota. .
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(a)
(b)
(a)
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Diazinon ha causato effetti significativi e aumenti dose-dipendenti sulla riproduzione (numero di covate per femmina) di entrambi i dafnidi (Tabella 1). Per D. magna, diazinon alla concentrazione fino a 0,1 µg·L−1 o superiore ha comportato una significativa diminuzione della riproduzione (numero di covate per femmina), mentre per D. lumholtzi è stata registrata una significativa riduzione della riproduzione dalla concentrazione più bassa testata (0,05 µg * L−1). La riproduzione di entrambi i dafnidi è stata significativamente ritardata (), da 6,5 giorni per il controllo a 9,6 giorni per D. magna (come concentrazione di diazinon fino a 0,1 µg * L−1 o superiore) e da 3,5 giorni nel controllo a 5,4 giorni per D. lumholtzi (come concentrazione diazinon fino a 0,05 µg·L−1 o superiore) (Tabella 1). I risultati di entrambe le specie testate hanno indicato che il numero di neonati nati per femmina è diminuito significativamente alla concentrazione di diazinon di 0,1 µg·L−1 o superiore (Tabella 1). La lunghezza corporea media è diminuita significativamente in questi dafnidi (come concentrazione di diazinone fino a 0,2 µg·L−1 o superiore) entro il periodo di prova di 14 giorni, da 4,1 a 3,1 mm e da 2,4 a 1,9 mm in D. magna e D. lumholtzi, rispettivamente.
I risultati della storia della risposta alla vita di entrambe le specie D. magna e D. lumholtzi. L’esposizione a concentrazioni subletali di diazinon in condizioni di laboratorio ha mostrato che diazinon ha ridotto significativamente il numero di prole prodotta per femmina e ritardato nell’età alla prima covata. I risultati ottenuti sono in accordo con le osservazioni precedenti che hanno mostrato una diminuzione della produzione media di prole e la soppressione della crescita in D. magna o Ceriodaphnia dubia dopo l’esposizione a diazinon .
I risultati del test chronic hanno mostrato che D. lumholtzi era una specie sensibile al diazinon. Sánchez et al. ha suggerito che i crostacei sono strettamente correlati agli insetti, più di altri invertebrati. Quindi, sono più sensibili ai pesticidi rispetto ad altri invertebrati. Modra et al. ha indicato che la tossicità di diazinon è influenzata da molti fattori come la capacità di biotrasformazione dell’organismo stesso, la temperatura dell’acqua, la presenza di altri inquinanti e altre variabili ambientali non identificate. D’altra parte, utilizzando un modello cinetico e dinamico tossico per studiare la tossicità del diazinone, Kretschmann et al. ha suggerito che la sensibilità delle specie in esame a diazinon può dipendere dalla capacità di disintossicazione di diazinon e diazoxon (un metabolita tossico di diazoxon). Questi autori hanno rivelato che, rispetto a D. magna, il crostaceo anfipode Gammarus pulex è meno sensibile al diazinone perché la disintossicazione di diazinon e diazoxon è sei volte più veloce, il che a sua volta causa effetti meno dannosi. Gli autori hanno anche suggerito che i modelli di effetto basati sulla meccanicistica dovrebbero essere usati per spiegare le cause effettive, gli effetti e le differenze minori tra i diversi invertebrati acquatici .
3.3. Effetti di Diazinon sul tasso di aumento della popolazione
Gli effetti di diazinon sull’RPI sono mostrati nella Figura 2. Concentrazioni di diazinon uguali e / o superiori a 0,1 µg·L−1 hanno ridotto significativamente l’RPI di entrambi i dafnidi durante il test cronico di 14 giorni (). Si può osservare che entrambi i dafnidi esposti a diazinon hanno mostrato una tendenza quasi simile durante il test cronico di 14 giorni. In ambienti naturali, è noto che il diazinone causa effetti avversi su molte specie di zooplancton, inclusa la Dafnia, anche a basse concentrazioni (da 5,3 a 26,3 nM) . L’RPI della popolazione Daphnia è un indicatore importante per le tendenze della popolazione di previsione. Il tasso di sopravvivenza, il numero di prole per femmina e l’età della fecondità sono tutti cruciali per la previsione . Una riduzione dell’RPI ha indicato lo stress tossico cronico dei pesticidi sulla Dafnia .
I nostri risultati hanno indicato che entrambe le specie di prova erano sensibili al diazinon e potrebbero essere impiegate per prevedere il rischio di insetticidi. I risultati attuali suggeriscono chiaramente che i tassi di crescita di D. magna e D. lumholtzi nei trattamenti di controllo erano all’interno dell’intervallo riportato in letteratura . Nei paesi tropicali, è necessario stabilire il punto di riferimento per gli insetticidi organofosfati. Per ridurre al minimo il rischio ambientale associato ai pesticidi negli ecosistemi tropicali, raccomandiamo vivamente ulteriori studi sugli effetti tossici a breve ea lungo termine degli insetticidi organofosfati su diversi gruppi tropicali di organismi.
4. Conclusioni
Il presente studio ha confermato che il diazinon presenta un rischio significativo per gli organismi acquatici, in particolare le specie di Dafnia non bersaglio. La crescita della popolazione di D. magna e D. lumholtzi è stato influenzato negativamente da diazinon dopo un periodo di esposizione cronica. Rispetto a D. magna, D. lumholtzi ha mostrato una sensibilità ancora più elevata al diazinone nel test acuto. I risultati di questo studio sono importanti per la previsione degli effetti tossici e del rischio ambientale associato agli insetticidi. Per valutare il possibile rischio ambientale associato ai pesticidi negli ecosistemi acquatici tropicali sono necessari ulteriori studi con insetticidi organofosfati aggiuntivi, diverse specie di test tropicali e condizioni di test.