Creazione di un test di legame competitivo che identifichi le diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti del virus dell’epatite E

Abstract

Obiettivi: Confermare le diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti specifici del genotipo e comuni del virus dell’epatite E (HEV). Metodo: È stato stabilito un test di legame competitivo con anticorpi monoclonali neutralizzanti comuni del genotipo (MABS) 3G1 e 5G5 e con MABS neutralizzanti specifici del genotipo 2B1 e 4C5. HEV ORF2 ricombinante p166W01 derivato dal genotipo 1 e p166Chn derivato dal genotipo 4 sono stati utilizzati come antigeni rivestiti, per determinare se i MAB riconoscono epitopi indipendenti, simili o sovrapposti. I MAB sono stati prodotti, purificati e coniugati con perossidasi di rafano (HRP). HRP-coniugato 2B1 potrebbe reagire solo con p166W01 ma non p166Chn, HRP-coniugato 4C5 potrebbe reagire solo con p166Chn ma non p166W01, mentre HRP-coniugato 3G1 e 5G5 potrebbe reagire sia con p166W01 e p166Chn. Pertanto, i test di legame competitivi sono stati eseguiti successivamente utilizzando l’antigene p166W01 e p166Chn. Risultati e conclusioni: I risultati dei test di legame competitivi hanno rivelato che il legame di 2B1 coniugato con HRP a p166W01 non poteva essere inibito da 5G5 o 3G1. Allo stesso modo, il legame di 4C5 coniugato con HRP a p166Chn non può essere inibito da 5G5 o 3G1. Tuttavia, i mAbs 5G5 e 3G1 hanno bloccato il legame reciproco con p166W01 e p166Chn, suggerendo che i MAB neutralizzanti comuni e specifici del genotipo riconoscono epitopi indipendenti.

© 2018 S. Karger AG, Basel

Introduzione

Il virus dell’epatite E (HEV) è un virus a RNA a filamento positivo non evoluto che si trasmette principalmente per via orale e causa epatite acuta umana E . L’infezione da HEV può portare a prognostici dannosi, ad esempio insufficienza della vita, epatite acuta grave, infezione cronica nell’organo trapiantato e nei pazienti immunosoppressi e alta mortalità nelle donne in gravidanza . Oltre all’infezione confermata negli esseri umani, gli HEV infettano anche gli animali e possono essere trasmessi dagli animali agli esseri umani; anche l’incidenza dell’infezione da epatite E nei paesi sviluppati è aumentata in modo significativo . Questi risultati indicano che HEV rappresenta una minaccia per la salute pubblica in tutto il mondo .

Sebbene sia stato riconosciuto un sierotipo, gli isolati HEV, derivati da diverse aree in tutto il mondo, potrebbero essere classificati in 4 genotipi principali . Gli HEV dei genotipi 1 e 2 differiscono dai genotipi 3 e 4 nelle loro caratteristiche epidemiologiche, antigeniche e immunogeniche .

Ad oggi, la ricerca sulla caratterizzazione dell’epitopo antigenico basata principalmente sulla proteina strutturale HEV per un sistema di coltura in vitro non è disponibile . pORF2 è la principale proteina strutturale HEV codificata da ORF2, che è 1 dei 3 fotogrammi di lettura aperti sovrapposti (ORFs) del genoma virale . Le regioni immunogeniche predominanti di pORF2 sono state localizzate nella regione C-terminale 2/3, che erano i principali obiettivi dello sviluppo del vaccino .

Il nostro precedente studio ha rivelato l’esistenza di una differenza di immunogenicità tra il vaccino dell’epatite E p179 (439-617 aminoacidi della proteina ORF2) derivato dal genotipo 4 e p239 (Ecolina) derivato dal genotipo 1, la differenza può essere attribuita alla presenza di epitopi specifici del genotipo HEV . Anticorpi monoclonali (mAbs) prodotti in topi immunizzati rispettivamente con p166Sar(452-617 aminoacidi della proteina ORF2) derivati dal genotipo 1 e p166Chn derivati dal genotipo 4 sono stati utilizzati per confermare la presenza di epitopi ge notype-specifici. Oltre a 2 MAB neutralizzanti comuni al genotipo, 3G1 e 5G5, sono stati ottenuti anche 2 MAB neutralizzanti specifici al genotipo, 2B1 e 4C5. 2B1 contro p166Sar potrebbe specificamente legarsi ai genotipi 1 e 2 proteine ricombinanti e neutralizzato solo genotipi 1 e 2 ceppi in vitro; 4C5 contro p166Chn immunoreacted specificamente contro i genotipi 3 e 4 proteine ricombinanti e neutralizzato solo genotipo 3 e 4 ceppi, mentre 3G1 contro p166Sar e 5G5 contro p166Chn potrebbe legarsi ai genotipi 1-4 proteine ricombinanti e neutralizzato 4 ceppi di genotipo . Per ulteriori studi sulle diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti comuni e specifici del genotipo di HEV, è stato sviluppato un test di legame competitivo utilizzando MABS 2B1, 3G1, 4C5 e 5G5, per confermare se gli epitopi riconosciuti da MABS sono indipendenti, simili o sovrapposti.

Materiali e metodi

Proteine ricombinanti

La p166 ricombinante era una proteina troncata di pORF2, le sequenze nucleotidiche erano derivate dai seguenti ceppi HEV: W01 (genotipo 1, JX857689) e China-9829 (genotipo 4, AY789225). Plasmidi ricombinanti sono stati costruiti ed espressi in Escherichia coli . Le 2 proteine p166 con tag His sono state designate rispettivamente come p166W01 e p166Chn.

Produzione di mAb

Un totale di 4 MAB neutralizzanti, 2B1, 3G1, 4C5 e 5G5 descritti in precedenza, sono stati utilizzati per sviluppare un saggio immunoassorbente competitivo legato all’enzima (ELISA). 2B1 e 3G1 sono stati sollevati contro p166Sar; 4C5 e 5G5 sono stati sollevati contro p166Chn . I mAbs sono stati prodotti iniettando 106 cellule di ibridoma nella cavità peritoneale di un topo BALB/c; il fluido di ascite contenente MABS è stato raccolto dopo 7-10 giorni, filtrato, centrifugato e conservato a -80°C.

Purificazione di mAbs

Il liquido di ascite di mAb è stato purificato usando la cromatografia di affinità della colonna di proteina G-sepharose (Sigma, Germania). Le frazioni contenenti anticorpi sono state raccolte utilizzando il tampone di eluizione acida (0,1 M glicina-HCl, pH 2,8) dalla proteina G immobilizzata e quindi determinate a 280 nm; l’assorbanza a 280 nm (A280) può essere utilizzata per quantificare approssimativamente il mAbs. L’elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide è stata utilizzata per confermare e quantificare le frazioni purificate utilizzando l’albumina sierica bovina .

Accoppiamento della perossidasi di rafano con mAbs

I MAB purificati sono stati dializzati contro tampone carbonato/bicarbonato di 100 mm (pH 9,3) a 4°C durante la notte . Gli anticorpi sono stati accoppiati alla perossidasi di rafano (HRP) secondo le istruzioni del produttore (KPL). Circa 1,5 mg di HRP sono stati miscelati con 0,5 mg di mAb in 0,5 ml di volume totale di tampone di coniugazione HRP, mescolando delicatamente a temperatura ambiente per 1 h. La miscela è stata lasciata a temperatura ambiente per 15 min dopo aver aggiunto 10 µl dell’agente riducente, e quindi è stato aggiunto 1 volume di glicerolo distillato per la conservazione e l’ulteriore utilizzo.

Reattività crociata di MAB coniugati con HRP all’antigene eterologo p166

Il metodo ELISA è stato applicato per confermare la reattività crociata di MAB coniugati con HRP con l’antigene p166W01 e p166Chn . In breve, i pozzetti di micropiastre sono stati rivestiti con 100 ng dell’antigene p166W01 e p166Chn, rispettivamente, incubati per 2 h a 37°C. Questo è stato seguito dalla rimozione di antigeni rivestiti; 200 µL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina sono stati aggiunti nei pozzetti e quindi le micropiastre sono state incubate a temperatura ambiente con agitazione delicata. Due ore dopo, il buffer di blocco è stato scartato e i pozzetti sono stati lavati due volte con PBS contenente 0,05% Tween-20 (PBST). Diluizioni seriali di 2 volte di MAB coniugati con HRP che vanno da 1: 400 a 1: 25,600 in PBS di caseina 1% sono state aggiunte nei pozzetti corrispondenti, seguite da 45 min di incubazione a 37°C; la caseina PBS è stata rimossa lavando 5 volte con PBST. Il substrato liquido di tetrametilbenzidina è stato aggiunto per lo sviluppo del colore per l’incubazione a 37°C per 10 min. Infine, la densità ottica (OD) di ciascun pozzetto è stata letta a 450 nm, con una lunghezza d’onda di riferimento di 630 nm.

Determinazione dei titoli di antigene e mAb

I titoli di antigene e MAB sono stati determinati utilizzando un ELISA. Inizialmente, sono state preparate diluizioni seriali di 2 volte di MAB coniugati con HRP che vanno da 1: 400 a 1: 25,600 in PBS di caseina all ‘ 1%, quindi aggiunte a pozzetti preverniciati con diluizioni seriali di antigene p166W01 o p166Chn. Seguita da un’incubazione di 45 minuti a 37°C, i MAB non legati sono stati rimossi lavando 5 volte con PBST. Il substrato liquido della tetrametilbenzidina è stato aggiunto per lo sviluppo del colore per un’incubazione di 10 minuti a 37°C. Infine, l’OD di ciascun pozzetto è stato letto a 450 nm, con una lunghezza d’onda di riferimento di 630 nm, per determinare la diluizione che stava subsaturando e ha dato una lettura OD di circa 1,0 a 450 nm, con una lunghezza d’onda di riferimento di 630 nm.

Test di legame competitivo

Le diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti comuni e specifici del genotipo di HEV sono state studiate utilizzando un test di legame competitivo a coppie stabilito con MAB neutralizzanti comuni e specifici del genotipo . I metodi erano simili alle procedure sopra descritte, tranne che p166W01 e p166Chn sono stati utilizzati rispettivamente come antigene di rivestimento e miscele di MAB coniugato con HRP a due volte la concentrazione e una concentrazione satura di mAb non coniugato è stata aggiunta ai pozzetti rivestiti. L’OD è stato misurato a 450 nm, con una lunghezza d’onda di riferimento di 630 nm. L’inibizione percentuale è stata calcolata utilizzando la formula: 100 × . La concorrenza è stata valutata come positiva se la percentuale di inibizione era superiore al 50%.

Risultati

Reattività crociata di MAB coniugati con HRP all’antigene eterologo p166

Il metodo ELISA è stato applicato per valutare la reattività crociata di MAB coniugati con HRP agli antigeni p166W01 e p166Chn. I risultati hanno rivelato che HRP-coniugato 2B1 a diluizioni da 1: 400 a 1: 25,600 ha reagito solo con p166W01, ma non con p166Chn, e HRP-coniugato 4C5 a diluizioni da 1: 400 a 1: 25,600 ha reagito solo con p166Chn. Al contrario, 3G1 e 5G5 coniugati con HRP a diluizioni da 1: 400 a 1: 25.600 hanno reagito bene con le proteine 2 p166 (Fig. 1). Queste osservazioni erano simili ai risultati precedenti, 2B1 e 4C5 sono MAB specifici del genotipo, mentre 3G1 e 5G5 sono MAB comuni al genotipo .

Determinazione dell’antigene p166W01 e dei titoli MAB coniugati con HRP per il test di legame competitivo

L’antigene p166W01 è stato utilizzato per stabilire il test di legame competitivo di MABS 2B1, 3G1 e 5G5; i titoli appropriati di MABS e antigene sono stati determinati utilizzando ELISA. Come mostrato nella Tabella 1, dopo titolazione quadrata, quando la diluizione dell’antigene p166W01 era 1: 400, 2B1 coniugato con HRP era 1: 6.400, il valore medio di OD era vicino a 1,0. Nel frattempo, come mostrato nella Tabella 2, quando la diluizione dell’antigene era 1: 400, 5G5 coniugato con HRP e 3G1 coniugato con HRP erano 1: 6.400 e 1: 12.800, rispettivamente, e il valore medio di OD era vicino a 1,0.

Determinazione del p166Chn Antigene e HRP-Coniugato mAb Titoli per il legame Competitivo Dosaggio

p166Chn antigene è stato utilizzato per stabilire il legame competitivo dosaggio di mAbs 4C5, 3G1, e 5G5, la corretta titoli di mAbs e antigene inoltre sono stati determinati mediante ELISA. Come mostrato nella Tabella 3, dopo titolazione quadrata, quando la diluizione dell’antigene p166Chn era 1: 800, 4C5 coniugato con HRP era 1: 6.400 e il valore medio di OD era vicino a 1,0. Nel frattempo, come mostrato nella Tabella 4, quando la diluizione dell’antigene era 1: 800, le diluizioni di 5G5 coniugato HRP e 3G1 coniugato HRP erano 1: 6.400 e 1: 12.800, rispettivamente; il valore medio di OD era vicino a 1.0.

Inibizione del legame di mAbs con p166W01

I risultati dell’inibizione sono mostrati nella Tabella 5; il legame di 2B1 coniugato con HRP all’antigene p166W01 è stato inibito da 2B1 non coniugato con inibizione del 68%. Non c’è stata inibizione significativa tra 2B1 con mAbs 5G5 e 3G1 (27 e 30%). L’inibizione più completa è stata ottenuta da MABS eterologo 3G1 e 5G5, poiché il legame di HRP-3G1 all’antigene è stato inibito da 5G5 con inibizione del 61%, 5G5 coniugato con HRP all’antigene è stato inibito da 3G1 con inibizione del 99%. Anche il legame di HRP-3G1 e HRP-5G5 con l’antigene p166W01 è stato quasi completamente inibito da soli (inibizione dell ’81 e dell’ 80%). Questi risultati suggeriscono che 3G1 e 5G5 possono condividere lo stesso epitopo o epitopo sovrapposto, ma 2B1 probabilmente riconosce un epitopo diverso.

l’Inibizione del legame di mAbs p166Chn

risultati di inibizione sono riportati in Tabella 5: l’associazione di HRP-4C5 per p166Chn è stato inibito da non coniugata 4C5 con il 69% di inibizione, non c’era alcuna significativa inibizione (il 25 e il 30%) ottenuti dalle altre 2 non coniugata mAbs 3G1 e 4C5. Tuttavia, un più alto tasso di inibizione è stato ottenuto dal legame coniugato HRP mAbs 3G1 e 5G5 all’antigene, inibito da 5G5 e 3G1 non coniugati con inibizione del 65 e del 76%. Anche il legame di 3G1 coniugato con HRP e 5G5 coniugato con HRP all’antigene p166Chn è stato quasi inibito da soli. Questi risultati suggeriscono anche che 3G1 e 5G5 possono condividere lo stesso epitopo o epitopo sovrapposto, mentre 4C5 probabilmente riconosce un epitopo diverso.

Discussione

Dal momento che il nuovo HEV suino è stato isolato per la prima volta , gli anticorpi anti-HEV sono stati segnalati in molti animali, hanno rivelato l’infezione da HEV tra animali e esseri umani, e questo può essere trasmesso dagli animali agli esseri umani . La riduzione della morbilità e della mortalità da epatite E dipendeva dalla prevenzione del vaccino e dalla diagnosi efficace. La conoscenza degli epitopi di HEV era essenziale per la preparazione del vaccino e lo sviluppo diagnostico . La rilevazione di anticorpi specifici nel siero è uno dei principali metodi diagnostici e vi è un numero crescente di saggi sierologici per il rilevamento di anticorpi. Tuttavia, i saggi utilizzati per rilevare anticorpi specifici variano notevolmente in sensibilità . Alcuni test diagnostici commerciali basati su antigeni di genotipo 1 o 2 non riescono a rilevare anticorpi sierici contro gli isolati di genotipi 3 o 4 . Poco si sa sui meccanismi alla base della non corrispondenza dei diversi test diagnostici.

Allo stato attuale, un sistema di coltura cellulare in vitro non è ancora disponibile per la ricerca HEV. Pertanto, pORF2 contenente la maggior parte dei siti immunogenici è stato ampiamente utilizzato per lo studio immunologico HEV, con un carattere conformazione-dipendente . La base strutturale di un immunogeno per suscitare anticorpi neutralizzanti e protettivi è l’epitopo neutralizzante, che è l’obiettivo principale dello sviluppo del vaccino contro l’epatite E. Abbiamo precedentemente riportato che la proteina p166, una proteina troncata di pORF2, può modellare epitopi neutralizzanti HEV e gli anticorpi sollevati contro p166 potrebbero neutralizzare diversi genotipi di HEV . Inoltre, il vaccino contro l’epatite E p239 derivato dal genotipo 1 HEV è stato efficace in uno studio clinico di fase 3 condotto nella provincia di Jiangsu, in Cina, dove l’isolato epidemico di HEV è il genotipo 4 . Questi risultati hanno rivelato che gli epitopi neutralizzanti comuni esistono all’interno dei diversi genotipi di HEV. Oltre all’epitopo(i) neutralizzante(i) comune (i), l’epitopo (i) specifico (i) del genotipo è stato confermato per esistere, per la preparazione e la caratterizzazione di mAb .

Per identificare ulteriormente la caratterizzazione di epitopi neutralizzanti comuni e specifici del genotipo, il test di inibizione competitiva è stato stabilito con MABS neutralizzanti comuni, 3G1 e 5G5 e MABS neutralizzanti specifici del genotipo, 2B1 e 4C5, per indagare il legame della concorrenza con l’antigene p166W01 o p166Chn e per determinare se

Inizialmente, i fluidi ascitici di mAbs 3G1, 2B1, 5G5 e 4C5 sono stati prodotti, purificati e coniugati con HRP. Il metodo ELISA è stato applicato per confrontare l’af finity vincolante di MABS coniugato con HRP con diversi genotipi di HEV p166. I risultati hanno rivelato che HRP-conjugat ed 2B1 ha reagito solo con genotipo 1 p166W01, ma non p166Chn. Allo stesso modo, 4C5 coniugato con HRP ha reagito solo con p166Chn. Al contrario, 3G1 e 5G5 coniugati con HRP hanno reagito bene contro le proteine del genotipo 2 p166. Quindi, i test di legame competitivi si basano sugli antigeni genotipo 1 e 4 HEV p166. I risultati delle analisi vincolanti competitive non sono sorprendenti, vale a dire. che il legame di 2B1 a p166W01 competeva solo da solo, mentre 3G1 e 5G5 potevano competere tra loro per il legame a p166W01. Inoltre, il legame di 4C5 a p166Chn era similmente solo gareggiato da solo, ma 3G1 e 5G5 potevano competere tra loro per il legame a p166Chn. Questi risultati hanno indicato che 3G1 e 5G5 riconoscono gli epitopi uguali o sovrapposti e che 2B1 e 4C5 riconoscono quelli diversi.

Questo è il primo studio che indaga le diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti conformazionali genotipo-comuni e genotipo-specifici di HEV. Abbiamo dimostrato che epitopi neutralizzanti comuni e specifici del genotipo possono essere indipendenti. Questa scoperta è molto utile per dimostrare i meccanismi alla base della bassa concordanza dei diversi test diagnostici. Ulteriori studi sono di importanza cruciale per chiarire le diverse caratteristiche degli epitopi neutralizzanti dell’HEV nell’efficacia dello sviluppo diagnostico e della preparazione del vaccino.

Riconoscimento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione di ricerca scientifica di dottorato di Anhui Medical University (No. 0110037101).

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