Croci genetiche

Una croce genetica è l’accoppiamento mirato di due individui con conseguente combinazione di materiale genetico nella prole. Le croci possono essere eseguite in molti sistemi modello – tra cui piante, lieviti, mosche e topi—e possono essere utilizzate per sezionare processi genetici o creare organismi con tratti nuovi.

Questo video tratterà alcuni dei principi delle croci genetiche, esaminerà un metodo per eseguire croci noto come analisi tetrad e discuterà diverse applicazioni di questa tecnica.

Per prima cosa, introduciamo i principi di base dell’ereditarietà che rendono possibili incroci genetici.

Il fenotipo di un organismo, o la composizione dei tratti, è influenzato dal suo corredo genetico o genotipo. Nella maggior parte degli organismi sessualmente riproduttori, la generazione genitoriale produce cellule gamete aploidi, che hanno una copia di ciascun cromosoma distinto. Questi poi si fondono durante l’accoppiamento per produrre una prole diploide con due copie omologhe di ciascun cromosoma. Se entrambi i cromosomi contengono lo stesso allele, o forma variante di un gene, allora l’organismo è “omozigote” in quel locus genetico; altrimenti, è “eterozigote.”

Per ricominciare il ciclo, l’organismo diploide genera nuovamente gameti aploidi attraverso la meiosi. Durante questo processo, i due cromosomi omologhi subiscono la “ricombinazione”, dove i pezzi delle sequenze equivalenti sono scambiati fra la coppia. Questo processo mescola gli alleli parentali ereditati da ogni prole, aumentando così la loro diversità genetica.

Una delle prime persone a realizzare incroci genetici sistematici fu il “padre della genetica” Gregor Mendel. Utilizzando la pianta di pisello facilmente manipolabile, ed esaminando una serie di tratti con modelli coerenti di eredità, Mendel è stato in grado di ricavare tre leggi fondamentali di eredità che costituirebbero la base della genetica.

La prima legge di Mendel è la Legge di Uniformità, che afferma che la prole eterozigote della prima generazione, o F1, di due individui omozigoti avrà il fenotipo di un solo genitore. L’allele che stabilisce questo fenotipo è chiamato “dominante”, mentre l’allele “nascosto” è “recessivo.”Ora sappiamo che le relazioni di dominanza sono spesso meno chiare, con casi come la dominanza incompleta, in cui gli eterozigoti esprimono un fenotipo misto; e la codominanza, in cui vengono visualizzati entrambi i fenotipi.

La Legge di segregazione afferma che un allele è assegnato in modo casuale a ciascun gamete. Osservando che la prole F2 dall’autofecondazione degli individui eterozigoti F1 mostrava un 3:1 rapporto fenotipico, ma che due degli individui fenotipicamente dominanti sono in realtà eterozigoti, Mendel dedusse che i due alleli parentali devono essere ereditati separatamente. Oggi, sappiamo che la segregazione si verifica durante la meiosi, quando i due cromosomi omologhi del genitore diploide sono divisi casualmente in cellule figlie aploidi, ciascuna ereditando uno dei due alleli.

La terza legge di Mendel è la Legge dell’Assortimento indipendente, che afferma che i tratti individuali sono ereditati indipendentemente. Ora sappiamo che l’indipendenza assoluta esiste solo per i tratti controllati da geni su cromosomi separati nell’insieme aploide, che sono distribuiti indipendentemente alle cellule figlie durante la meiosi. Per due geni sullo stesso cromosoma, la distanza tra loro è inversamente proporzionale alla probabilità che siano ricombinati su cromosomi omologhi diversi e, per estensione, quanto probabilmente siano ereditati insieme nella stessa prole. Pertanto, l’analisi dei quattro prodotti meiotici di un organismo diploide fornisce agli scienziati un modo per mappare la posizione dei geni.

Dopo aver esaminato i principi alla base delle croci genetiche, diamo un’occhiata a un protocollo per l’analisi della tetrade.

Questa tecnica viene tipicamente applicata a determinate alghe o funghi monocellulari, come il lievito, per sezionare i quattro prodotti meiotici aploidi, o spore, che in queste specie rimangono insieme come “tetrade” all’interno di un singolo corpo cellulare.

Per eseguire l’analisi della tetrade nel lievito, i ceppi desiderati vengono prima coltivati su supporti appropriati. Le cellule di lievito provenienti da singole colonie possono accoppiarsi, ad esempio striando ogni ceppo in un motivo incrociato su una nuova piastra. Questa piastra viene quindi replicata su supporti selettivi per isolare solo il prodotto diploide della croce.

Cellule diploidi selezionate vengono coltivate su terreni poveri di nutrienti per indurre sporulazione e formazione di tetradi. Gli asci, che sono le strutture che contengono i tetradi delle spore, vengono digeriti in soluzioni contenenti l’enzima zimoliasi. Dopo la digestione, i singoli asci vengono manipolati utilizzando un microscopio tetrad-dissecante. Sono disposti in posizioni specifiche su una piastra di crescita e interrotti per liberare le singole spore. Questi possono essere collocati in un modello di griglia-like, dove ogni sportivo genererebbe una colonia individuale che può essere ulteriormente analizzato.

Ora che sapete come viene eseguita l’analisi tetrad, esaminiamo alcune delle molte applicazioni o modifiche di questa tecnica.

La dissezione manuale dei tetradi richiede molto tempo e i ricercatori hanno ideato alternative ad alta produttività, come il sequenziamento dei tetradi con codice a barre. In questo metodo, la progenie diploide di una croce di lievito è stata trasformata con una libreria di plasmidi, ognuno dei quali contiene una breve sequenza unica nota come “codice a barre” che funge da identificatore per ogni progenie. I plasmidi esprimono anche GFP, consentendo di selezionare il lievito asci tramite citometria a flusso e di selezionarlo su piastre di agar. Gli asci venivano lisati in massa sulle piastre e le spore potevano crescere in piccole colonie. Le colonie sono state poi distribuite in modo casuale a piastre a 96 pozzetti per la genotipizzazione. Il codice a barre sequenza unica permette ai ricercatori di raggruppare le quattro colonie che sono sorti da spore da ogni tetrade.

Croci genetiche possono anche essere utilizzati per generare cellule di lievito con un gran numero di delezioni geniche. Nel processo green monster, il lievito mutante aploide che trasporta diverse delezioni genetiche contrassegnate da GFP viene accoppiato e sporulato. Queste progenie aploide, alcune delle quali portano eliminazioni ereditate da entrambi i genitori, sono ordinate tramite citometria a flusso attivata dalla fluorescenza, dove l’intensità della GFP è stata dimostrata in correlazione con il numero di eliminazioni presenti in un particolare ceppo di lievito. Queste cellule selezionate sono state poi coltivate e ri-incrociate. Ripetendo questo ciclo generato ceppi di lievito contenenti numerose eliminazioni.

Infine, le croci genetiche sono state adattate per l’uso in molti sistemi modello, come il plasmodio parassita intracellulare che causa la malaria. Poiché il parassita può riprodursi solo all’interno di altre cellule, tutti i passaggi di attraversamento devono essere eseguiti in topi o zanzare, rispettivamente l’ospite naturale e il vettore del parassita. Qui, i topi sono stati infettati da due ceppi plasmodici unici allo stadio di parassita del sangue. I parassiti venivano poi trasferiti nelle zanzare attraverso l’alimentazione del sangue, e una volta dentro maturavano in gameti che si fecondavano per formare zigoti diploidi. Gli sporozoiti maturi sono stati poi raccolti dalla zanzara e usati per infettare topi naïve, dove i parassiti sono stati propagati per isolare la progenie incrociata di interesse.

Hai appena visto il video di JoVE sulle croci genetiche. In questo video, abbiamo introdotto i principi dell’ereditarietà, come le croci genetiche in alcuni organismi possono essere analizzate con la dissezione tetradica e alcune applicazioni attuali. Come sempre, grazie per la visione!