Giemsa Macchia – linea di Principio, Procedure, Risultati, Interpretazione

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Ultimo Aggiornamento il 5 febbraio 2020 di Sagar Aryal

Introduzione

Giemsa macchia era un nome adottato dalla Germania, Chimico, scienziato, per la sua applicazione di una combinazione di reagenti nel dimostrare la presenza di parassiti della malaria.

Appartiene a un gruppo di macchie note come macchie Romanowsky. Si tratta di macchie neutre costituite da una miscela di blu di metilene ossidato, azzurro e eosina Y e eseguite su un vetrino essiccato all’aria che viene post-fissato con metanolo. Le macchie di Romanowsky sono applicate nella differenziazione delle cellule, esami patologici di campioni come film di sangue e midollo osseo e dimostrazione di parassiti, ad esempio malaria. Esistono quattro tipi di macchie Romanoswsky:

  • Giemsa macchia
  • Jenner Macchia
  • Wright macchia
  • May-Grunwald Macchia
  • Leishman macchia

Obiettivi di Giemsa macchia

  • Per preparare accuratamente il Giemsa macchia soluzione stock
  • Di macchia e di identificare le cellule del sangue
  • Per differenziare le cellule del sangue nuclei dal citoplasma

Principio

Giemsa macchia è un gold standard, tecnica di colorazione che viene utilizzato sia sottili e fitte macchie di esaminare il sangue per i parassiti della malaria, una routine di check-up per altri parassiti del sangue e per differenziare morfologicamente il nucleare e il citoplasma di eritrociti, leucociti e piastrine e parassiti.

Come ogni tipo di macchie Romanowsky, è composto sia dai coloranti acidi che basici, in relazione alle affinità di acidità e basicità per le cellule del sangue. Azzurro e blu di metilene, un colorante di base si lega al nucleo acido producendo colore blu-viola. L’eosina è un colorante acido che viene attratto dal citoplasma e dai granuli citoplasmatici che producono una colorazione rossa alcalina. La macchia deve essere tamponata con acqua a pH 6.8 o 7.2, per precipitare i coloranti per legare materiali semplici.

Classicamente, la macchia di Giemsa è una macchia differenziale che è costituita da una combinazione di reagenti (azzurro, blu di metilene e colorante di eosina) ampiamente utilizzati in citogenetica e istopatologia per la diagnosi di:

  1. Malaria, spirochete e del sangue di altri parassiti
  2. Chlamydia trachomatis corpi di inclusione
  3. Borrelia spp
  4. Yersinia pestis
  5. Histoplasma spp
  6. Pneumocystis jiroveci cisti

Reagenti Utilizzati

  • Metanolo
  • Giemsa polvere
  • Glicerina
  • Acqua (Buffer)

Procedura

Preparazione di Giemsa Macchia soluzione Stock (500ml)

  1. In 250 ml di metanolo, aggiungere 3,8 g di Giemsa polvere e sciogliere.
  2. Riscaldare la soluzione fino a ~60oC
  3. Quindi aggiungere 250 ml di glicerina alla soluzione, lentamente.
  4. Filtrare la soluzione e lasciarla riposare per circa 1-2 mesi prima dell’uso.

Preparazione della soluzione di Lavoro

  1. Aggiungere 10 ml di soluzione stock di 80 ml di acqua distillata e 10 ml di metanolo

procedura di Colorazione 1: a Film Sottile di colorazione

  1. Su asciutto e pulito, in microscopiche vetrino, fare un film sottile del campione (sangue) e lasciare asciugare all’aria.
  2. immergere lo striscio (2-3 tuffi) in metanolo puro per la fissazione dello striscio, lasciare asciugare all’aria per 30 secondi
  3. Inondare il vetrino con soluzione di macchia Giemsa al 5% per 20-30 minuti.
  4. a Filo con acqua di rubinetto e lasciare asciugare

NOTA: In caso di emergenza, lasciare il Giemsa macchia soluzione per 5-10 minuti

Procedura di Colorazione 2: Spessore del Film di Colorazione

  1. Aggiungere una spessa striscio di sangue e asciugare all’aria per 1 ora con una colorazione rack.
  2. Immergere lo striscio di sangue denso nella macchia Giemsa diluita (preparato prendendo 1 ml della soluzione madre e aggiungendo a 49 ml di tampone fosfato o acqua distillata, ma i risultati possono variare in modo diverso).
  3. Lavare striscio per immersione in acqua tamponata di acqua distillata per 3-5 minuti
  4. Lasciare asciugare

Risultati

Citoplasma granuli citoplasmatici delle cellule del sangue appaiono di colore rosso, mentre il nucleo appare blu-viola a colori.

Gli eritrociti appariranno rosa in clour

  • Gli eosinofili avranno un nucleo blu-viola, un citoplasma rosa pallido e granuli rosso-arancio.
  • I neutrofili appariranno nucleo rosso porpora e un citoplasma rosa.
  • I basofili avranno un nucleo viola e granuli bluastri.
  • I linfociti hanno un nucleo blu scuro e un citoplasma azzurro.
  • I monociti avranno un nucleo viola e un citoplasma rosa.
  • Le piastrine avranno granuli viola.

Giemsa Stain - Principio, Procedura, risultati, Interpretazione

Fonte immagine: Wikipedia

Interpretazione

Azzurro e blu di metilene, un colorante di base si lega al nucleo acido producendo colore blu-viola. L’eosina è un colorante acido che viene attratto dal citoplasma e dai granuli citoplasmatici che producono una colorazione rosso-arancio alcalina.

Applicazioni Giemsa stain

  1. Giemsa stain è specifico per i gruppi fosfatici del DNA. Si attacca alle regioni del DNA con elevate quantità di legame adenina-timina.
  2. Giemsa stain è usato nella Giemsa banding (G-banding), per macchiare i cromosomi ed è spesso usato per creare una rappresentazione schematica dei cromosomi (idiogramma).
  3. Essendo una macchia differenziale, la macchia Giemsa può essere utilizzata per studiare l’aderenza dei batteri patogeni alle cellule umane, differenziando le cellule umane come viola e le cellule batteriche come rosa.
  4. Può essere utilizzato per la diagnosi istopatologica della malaria e di alcuni parassiti del sangue spirochete e protozoi.
  5. È anche usato nella macchia di tessuto di Wolbach i.e colorazione del tessuto ematopoietico e per l’identificazione di batteri e rickettsia
  6. Giemsa stain è un classico blood film stain per strisci di sangue periferico e campioni di midollo osseo. I globuli rossi macchiano il rosa, le piastrine macchiano un rosa pallido chiaro, le macchie del citoplasma dei linfociti blu cielo, le macchie del citoplasma dei monociti blu pallido e le macchie della cromatina nucleare dei leucociti magenta.
  7. Giemsa stain viene anche utilizzato per visualizzare i cromosomi, identificando anomalie cromosomiche come traslocazione e riarrangiamento,
  8. Giemsa colora l’istoplasma del fungo, i batteri della clamidia e può essere utilizzato per identificare i mastociti.

Vantaggi

  • Prontamente disponibile, facile da preparare, mantenere e utilizzare

Limitazioni

  • Lavorare Giemsa macchia deve essere preparato poco prima dell’uso.
  1. Tecniche di colorazione: Giemsa di Kathleen P Freeman, Karen L Gerber: Vetstream
  2. Paramedic World; Ematologia Tirocinio/colorazione di Giemsa Tecnica
  3. Come Romanowsky macchie lavoro e perché sono sempre di valore – tra cui una proposta universale Romanowsky colorazione meccanica razionale schema di risoluzione dei problemi da Horobin RW./ncbi.nlm.nih.gov

Fonti Internet

  • 13% – https://en.wikipedia.org/wiki/Giemsa_stain
  • 3% – http://pathonet.com/pathonet/education-stainings
  • 1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC540181/
  • 1% – https://clinicalgate.com/preparation-and-staining-methods-for-blood-and-bone-marrow-films/
  • <1% – https://www.researchgate.net/publication/24346194_Histopathology_for_the_diagnosis_of_infectious_diseases
  • <1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1453983/
  • <1% – https://chlorine.americanchemistry.com/Science-Center/Chlorine-Compound-of-the-Month-Library/Methylene-Blue-Part-2-The-Chemists-Indicator/
  • <1% – https://answers.yahoo.com/question/index?qid=20080712002122AAAhrqK