Il genotipo 4G / 4G del gene PAI-1 è associato a un ridotto rischio di ictus negli anziani

Inibitore dell’attivatore del plasminogeno di tipo 1 (PAI-1), che forma un complesso con attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA), è1 Elevata attività di PAI-1 è stata associata ad un aumentato rischio di eventi coronarici in popolazioni con angina pectoris2,3 e in pazienti post–infarto miocardico (MI).4,5 Tuttavia, PAI-1 non è probabilmente un fattore di rischio indipendente per la malattia coronarica in generale (sano) popolazioni.6-9

Il polimorfismo 4G/5G è un polimorfismo comune nella regione del promotore del gene PAI-1.10 Entrambi gli alleli 4G e 5G hanno un sito di legame per un attivatore di trascrizione. L’allele 5G, tuttavia, ha un sito di legame aggiuntivo per un repressore, con conseguente riduzione dei tassi di trascrizione e meno attività PAI-1.11-13 Un’associazione tra il polimorfismo 4G/5G e la malattia cardiovascolare (CVD) fornirebbe supporto per un ruolo causale di PAI-1 poiché è improbabile che il livello geneticamente determinato sia influenzato dal processo di malattia (infiammatoria) e dai fattori di rischio cardiovascolare. Una recente meta-analisi di 9 studi ha mostrato un aumento del 20% del rischio di infarto miocardico per il genotipo 4G/4G.14

Le associazioni di PAI-1 e il polimorfismo 4G/5G con ictus hanno ricevuto poca attenzione rispetto alla relazione con la malattia coronarica. Nello studio MONICA (Northern Sweden Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease), il rischio di primo ictus è stato previsto dal complesso tPA*PAI-1 ma non dall’attività PAI-1.15 Dati epidemiologici suggeriscono un effetto protettivo dell’allele 4G contro gli eventi cerebrovascolari.16-21 Nel presente studio basato sulla popolazione in 637 anziani olandesi, abbiamo esaminato gli effetti separati e combinati dell’attività PAI-1 e del polimorfismo 4G/5G sull’incidenza di eventi cardiovascolari.

Soggetti e metodi

Popolazione dello studio

Lo studio Arnhem Anziani è uno studio di coorte basato sulla popolazione iniziato nel 1991/1992. Abbiamo invitato un campione casuale (stratificato per età e sesso) di 1793 uomini e donne che vivono in modo indipendente di età compresa tra 65 e 84 anni nella città di Arnhem, Paesi Bassi. Un totale di 1012 soggetti hanno accettato di essere intervistati, e 685 hanno accettato di avere un esame fisico e venipuntura. La progettazione dello studio e le caratteristiche della popolazione sono state descritte in dettaglio altrove.22

In 641 soggetti è stato ottenuto un singolo campione di sangue non fondente. I dati sia sull’attività PAI-1 che sul polimorfismo 4G/5G mancavano per 4 soggetti, lasciando 637 soggetti per la presente analisi. L’attività PAI-1 non è stata valutata per 31 soggetti e la genotipizzazione non ha avuto successo per 8 soggetti. La popolazione per il presente studio comprendeva più uomini rispetto alla popolazione che non ha partecipato o ha avuto solo un colloquio (52% rispetto a 44%; P=0,01) ed era significativamente più giovane (73,6 rispetto a 76,1 anni; P<0,001). Altre caratteristiche, compresi i fattori di stile di vita e la salute auto-percepita, non differivano significativamente tra questi gruppi. Tutti i soggetti hanno fornito il consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dal comitato etico dell’Università di Wageningen.

Raccolta dati

Gli intervistatori addestrati hanno raccolto dati sullo stile di vita, sulla salute attuale e passata e sui farmaci. Stato di fumare è stato codificato come corrente, ex, o mai. L’indice di massa corporea (BMI) è stato calcolato come peso diviso per altezza al quadrato (kg/m2). La CVD è stata considerata presente se i soggetti hanno riportato una storia di malattie cardiache o ictus. I soggetti sono stati considerati in terapia cardiovascolare se avevano usato inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina, β-bloccanti, agenti trombolitici, agenti lipidici e/o salicilati durante i 3 mesi precedenti l’intervista. L’ipertensione è stata definita come pressione arteriosa ≥160/95 mm Hg o uso di farmaci antipertensivi.

Le determinazioni di laboratorio

La venipuntura è stata eseguita tra le 8 del mattino e le 5:30 pm con l’uso di tubi di raccolta del citrato e il tempo di campionamento del sangue è stato registrato. I campioni sono stati conservati a -80°C. L’attività del plasma PAI-1 è stata determinata con il kit Chromolize (Biopool). La variabile per PAI-1 che è stata utilizzata in questo studio è la porzione di PAI-1 totale che rimane dopo la formazione del complesso tPA*PAI-1. L’antigene tPA è stato misurato con il kit Imulyse (Biopool). La genotipizzazione 4G / 5G è stata eseguita secondo Margaglione et al,23 con una leggera modifica. In breve, è stato sintetizzato un oligonucleotide mutato, che ha inserito un sito per l’enzima BseLI all’interno del prodotto di amplificazione. I prodotti della reazione a catena della polimerasi sono stati digeriti a 55 ° C con l’enzima BseLI (MBI Fermentas). Il colesterolo totale sierico è stato determinato enzimaticamente (CHOD-PAP) e i livelli di colesterolo HDL e LDL sono stati misurati direttamente (metodo Dimensionale HDL e LDL N-geneo, rispettivamente). L’insulina sierica è stata determinata con un test immunometrico (insulina Immulite 2000). La proteina C-reattiva (CRP) è stata valutata con una procedura di analisi immunoassorbente legata agli enzimi altamente sensibile.24

Follow-up

I registri comunali hanno fornito dati sulla mortalità e la migrazione fino al febbraio 2001. Una persona è stata persa per il follow-up a causa dell’emigrazione. I dati sulla morbilità e la mortalità causa-specifica sono stati ottenuti dai medici di medicina generale per mezzo di un modulo standard. Nei Paesi Bassi, il medico generico costituisce il collegamento centrale a tutte le cure mediche specializzate e gli eventi clinici sono improbabili da perdere con la nostra procedura di follow-up. Trentanove soggetti non hanno dato alcun permesso per la raccolta di dati di follow-up. Per un certo numero di soggetti, il medico generico non è stato rintracciato (n=31), non ha collaborato (n=39) o non ha fornito dati adeguati (n=10). Il follow-up sulla morbilità e sulla mortalità causa-specifica è stato completo per 518 soggetti (268 uomini e 250 donne; l ‘ 81% dei soggetti con dati sul genotipo PAI-1 e/o 4G/5G). Le caratteristiche dei soggetti che sono stati seguiti sono state simili a quelle dei soggetti che non sono stati seguiti, ad eccezione di un livello di colesterolo sierico più basso (6,0 verso 6,3 mmol/L; P=0,02).

Gli eventi cardiovascolari e le cause di morte sono stati codificati da un medico (E. J. G.) sulla base delle informazioni ottenute dal medico generico, secondo la Classificazione statistica internazionale delle malattie, 10a revisione (ICD-10). Gli endpoint comprendevano mortalità per tutte le cause, mortalità cardiovascolare (codici ICD da I00 a I96), incidenza di infarto miocardico (da I21 a I22, fatale e non fatale), incidenza di ictus (da I60 a I69, fatale e non fatale) e incidenza di attacco ischemico transitorio (TIA) (G45). In caso di eventi ricorrenti, solo il primo evento è stato considerato nell’analisi.

Analisi statistica

Le differenze nelle caratteristiche del soggetto tra i genotipi 4G/5G sono state testate con test ANOVA (variabili continue) o χ2 (variabili categoriali). La presenza dell’equilibrio Hardy-Weinberg per il polimorfismo 4G/5G è stata esaminata dal test χ2. I coefficienti di correlazione di Spearman (rs) sono stati calcolati per l’associazione di PAI-1 con altri fattori di rischio cardiovascolare. I rapporti di pericolosità (successivamente denominati rischi relativi) nei terili di PAI-1 e tPA sono stati ottenuti mediante analisi di pericolosità proporzionale alla Cox, con il terile più basso utilizzato come riferimento. Le RRS sono state aggiustate per età e sesso (modello 1) e in aggiunta per BMI, stato di fumo (attuale, precedente, mai), storia di CVD, farmaci cardiovascolari, ipertensione, colesterolo totale, colesterolo LDL e CRP sierica (modello 2). Le analisi di PAI-1 e tPA sono state ulteriormente aggiustate per il tempo di prelievo del sangue a causa della variazione circadiana. Il sistema SAS è stato utilizzato per analisi statistiche. Il livello di significatività è stato impostato su un valore di probabilità a 2 lati < 0,05.

Risultati

Il rischio di eventi cardiovascolari e di mortalità per tutte le cause nei terzi di attività PAI-1 (<0,9, 0,9-3,9 e >3,9 UI/mL) è mostrato nella Tabella 2. Un rischio aumentato di 3 volte di colpo è stato osservato nei terili medi e più alti di PAI-1, che è diventato più forte (RR >5) dopo aggiustamento per fattori di rischio cardiovascolari (principalmente BMI e lipidi sierici). L’esclusione di 129 soggetti con una storia di CVD non ha modificato le relazioni (dati non mostrati). Ulteriori aggiustamenti per la tPA hanno attenuato in qualche modo l’associazione di PAI-1 con la mortalità cardiovascolare (RR=2,0; IC al 95%, da 1,0 a 3,9 nel terzo medio, e RR=2,5; IC al 95%, da 1,1 a 5,7 nel terzo più alto) e la mortalità complessiva (RR=1,1; IC al 95%, da 0,8 a 1,6, e RR=1,4; IC al 95%, da 0,9 a 2,1, rispettivamente). L’attività PAI-1 è stata positivamente associata all’incidenza di MI e TIA, ma la tendenza tra i tertili non ha raggiunto la significatività statistica (Tabella 2).

L’associazione del genotipo 4G/5G con eventi cardiovascolari e mortalità per tutte le cause è presentata nella Tabella 3. Dopo aggiustamento per età e sesso, il rischio di ictus, TIA e mortalità cardiovascolare è stato ridotto di >50% nei soggetti con genotipo 4G/4G. L’aggiustamento per i fattori di rischio cardiovascolare (modello 2) non ha modificato materialmente queste associazioni. Limitare l’analisi all’ictus ischemico ha prodotto un rischio più fortemente diminuito per il genotipo 4G/4G (RR=0,2; IC al 95%, da 0,04 a 1,0). Il polimorfismo 4G / 5G non ha predetto in modo significativo l’infarto miocardico e la mortalità per tutte le cause (Tabella 3).

La figura 1 mostra una panoramica degli studi epidemiologici sul polimorfismo 4G/5G e sull’ictus. La figura 2 presenta il rischio di ictus nelle categorie di plasma PAI-1, genotipo 4G / 5G e questi fattori combinati. La sopravvivenza libera da ictus prevista a 10 anni è stata fortemente ridotta al 72,2% nei portatori 5G con PAI-1 elevato (≥0,9 UI/mL) rispetto al 97,6% per gli omozigoti 4G con PAI-1 basso (<0,9 UI/mL). Cox proporzionale analisi del rischio aggiustato per età, sesso, e il tempo di prelievo di sangue ha mostrato risultati simili.

Discussione

In una popolazione generale di anziani olandesi, abbiamo riscontrato un rischio fortemente ridotto di ictus, TIA e mortalità cardiovascolare per il genotipo 4G/4G del gene PAI-1. In contrasto con questo risultato, un’elevata attività di PAI-1 nel plasma è stata associata ad un aumentato rischio di eventi cerebrovascolari. Il rischio di ictus era notevolmente elevato nei portatori 5G con PAI-1 plasmatico elevato.

La nostra popolazione di studio non era in equilibrio Hardy-Weinberg per il polimorfismo 4G/5G (4G/4G, 31%; 4G/5G, 46%; e 5G/5G, 24%). Il genotipo 5G/5G sembra sovrarappresentato nella nostra popolazione rispetto a un altro studio olandese su > 12 000 donne (distribuzione del 31%, 51% e 18%, rispettivamente).20 Lo squilibrio nel nostro studio può derivare dalla selezione correlata al genotipo, probabilmente a causa dell’esclusione di anziani istituzionalizzati o della sopravvivenza differenziale. Tuttavia, la distribuzione del genotipo 4G / 5G nel nostro studio non era molto deviante da quella di altre popolazioni bianche. Nello studio di aterosclerosi insulino-resistenza, 25 la distribuzione nei bianchi era 29% per 4G/4G, 47% per 4G/5G e 25% per 5G/5G, che è stato segnalato per essere in equilibrio Hardy-Weinberg. In 205 soggetti di età > 80 anni, le corrispondenti distribuzioni sono state del 30%, 47% e 23%.26 A causa della natura prospettica delle nostre analisi, non pensiamo che l’assenza di un equilibrio Hardy-Weinberg per il polimorfismo 4G/5G abbia provocato una grande distorsione dei nostri risultati.

Segnaliamo un effetto protettivo dell’allele 4G contro l’ictus, che è in accordo con precedenti studi epidemiologici.16-21 Uno studio coreano ha prodotto dati contrastanti, probabilmente a causa di differenze razziali.27 Per quanto riguarda altri risultati, abbiamo osservato un modesto aumento del rischio di infarto miocardico nei soggetti 4G/4G. Questo risultato, anche se non statisticamente significativo, è in accordo con la meta-analisi di Boekholdt et al,14 che ha riportato un odds ratio complessivo di 1.2 (95% CI, 1.0 a 1.4). Abbiamo riscontrato un rischio fortemente ridotto di mortalità cardiovascolare per 4G/4G, probabilmente a causa di malattie cerebrovascolari che costituivano il 43% dei casi fatali.

Il plasma PAI-1 non sembrava essere un fattore di rischio molto forte per l’infarto miocardico nel nostro studio (RR ≈1.5). L’aggiustamento per il marcatore infiammatorio CRP o l’esclusione dei casi prevalenti di CVD non hanno influenzato questa relazione. I nostri dati sono in accordo con lo studio sulla salute cardiovascolare tra soggetti anziani, 6 in cui PAI-1 non era un forte predittore di eventi coronarici. Una relazione tra PAI-1 e infarto miocardico è stata trovata principalmente in pazienti con disturbi coronarici,2-5 che possono spiegare l’associazione relativamente debole in una popolazione generale di anziani. Siamo tra i primi a dimostrare che il plasma elevato PAI-1 (principalmente indipendente da 4G/5G) è un forte indicatore di rischio per l’ictus in età avanzata. Il meccanismo alla base dell’elevazione del PAI-1 può essere di origine genetica, ma la regolazione genetica del plasma PAI-1 è in gran parte sconosciuta. In alternativa, l’innalzamento del PAI-1 potrebbe essere causato da un meccanismo sottostante di insulino-resistenza e infiammazione sistemica, come parte del processo CVD.1

I nostri dati suggeriscono che l’associazione genotipo-fenotipo per il polimorfismo 4G/5G e PAI-1 è debole. La regolazione differenziale o la funzione di PAI-1 nel plasma e nel tessuto possono spiegare i risultati contrastanti per il polimorfismo 4G/5G e l’attività PAI-1 che abbiamo trovato in relazione all’ictus. Negli animali è stata dimostrata la produzione cellulare locale di PAI-1 e tPA e un ruolo definito di questo sistema di proteasi nei tessuti.28,29 Processi infiammatori localizzati svolgono un ruolo importante nel processo di aterosclerosi e rottura della placca. Sulla base dei nostri dati, suggeriamo che ci sono meccanismi locali nel tessuto cerebrale che rappresentano l’effetto protettivo di 4G/5G contro l’ictus. Ipotizziamo che nei siti infiammatori, l’aumento putativo di PAI-1 sia più forte per l’allele 4G e che questo inibisca la proteolisi. Ciò può, per esempio, provocare la stabilizzazione della placca e la neutralizzazione aumentata di tPA, che è potenzialmente neurotossica.30

In conclusione, i nostri dati suggeriscono un ruolo protettivo per l’allele 4G nello sviluppo dell’ictus in età avanzata, mentre l’attività del PAI-1 nel plasma sembra essere dannosa. Questa relazione apparentemente paradossale deve essere confermata in ampi studi basati sulla popolazione che si concentrano sia sull’attività PAI-1 che sul polimorfismo 4G/5G.

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