Obiettivo

Apprendere la tecnica dell’agglutinazione al lattice.

L’agglutinazione del lattice si osserva quando un campione contenente l’antigene specifico (o anticorpo) viene miscelato con un anticorpo (o antigene) rivestito sulla superficie delle particelle di lattice.

I test di agglutinazione del lattice sono stati applicati in laboratori clinici per l’individuazione di malattie infettive e nel 1956 Singer e Plotz hanno descritto per la prima volta il test del fattore reumatoide, un test basato sull’agglutinazione del lattice. Nell’artrite reumatoide (RA), gli anticorpi IgG prodotti dai linfociti nell’articolazione sinoviale reagiscono con gli anticorpi IgM (RF, fattore reumatoide) per generare immunocomplessi che attivano il complemento e causano la distruzione dei tessuti. L’AR ha un significato diagnostico.

Da allora, test per rilevare infezioni microbiche e virali, malattie autoimmuni, ormoni, farmaci e proteine del siero sono stati sviluppati e commercializzati da molte aziende in tutto il mondo. Il principio è utilizzato per la diagnosi di molte infezioni come l’epatite B, H. influenzae, N. meningitidis, ecc.. Tutti i metodi per rilevare o quantificare l’antigene o l’anticorpo sfruttano il fatto che reagiscono per formare un complesso. Alla concentrazione ottimale di antigene-anticorpo, questo complesso precipita. Tuttavia, se l’antigene è particolato in natura, si osserva agglutinazione del complesso antigene-anticorpo.

Reazioni di agglutinazione

La reazione tra un antigene particolato e un anticorpo provoca agglutinazione visibile chiamata agglutinazione. Gli anticorpi che producono tali reazioni sono noti come agglutinine. Il principio delle reazioni di agglutinazione è simile alle reazioni di precipitazione; dipendono dalla reticolazione degli antigeni polivalenti. Quando l’antigene è un eritrocita si chiama emoagglutinazione.Teoricamente tutti gli anticorpi possono agglutinare antigeni particolati ma IgM, a causa della sua elevata specificità è un’agglutinina particolarmente buona.

Non c’è agglutinazione può essere osservato quando la concentrazione di anticorpi è alta, (diluizioni inferiori), e quindi il campione viene diluito, agglutinazione si verifica. L’effetto prozone è definito come l’invisibilità dell’agglutinazione ad alte concentrazioni di anticorpi. È dovuto al motivo per cui l’anticorpo in eccesso forma complessi molto minuti che non si raggruppano per formare agglutinazione visibile.

Test di agglutinazione qualitativa

I test di agglutinazione possono essere utilizzati in modo qualitativo per valutare la presenza di un antigene o di un anticorpo. L’anticorpo viene miscelato con l’antigene del particolato e un test positivo è indicato dall’agglutinazione dell’antigene del particolato.

Ad esempio, per determinare il gruppo sanguigno del paziente i globuli rossi della persona possono essere miscelati con anticorpi a un antigene del gruppo sanguigno. Un altro esempio è che per testare la presenza di anticorpi in un campione di paziente, il siero del paziente viene miscelato con il globulo rosso (RBC) di un gruppo sanguigno noto.

Test di agglutinazione quantitativa

Per misurare il livello di anticorpi agli antigeni particolati, il test di agglutinazione può essere ampiamente utilizzato. Per questa prova, le diluizioni seriali del campione possono essere fatte ed è provato ad anticorpo. Quindi è possibile aggiungere una quantità fissa di antigene particolato o batteri o globuli rossi. Determinare la diluizione massima che forma l’agglutinazione e questa diluizione massima che dà agglutinazione osservabile è nota come titolo. I risultati sono mostrati come il reciproco della massima diluizione che forma agglutinazione visibile.

Emoagglutinazione passiva

La sensibilità e la semplicità delle reazioni di agglutinazione possono essere estese agli antigeni solubili con la tecnica dell’agglutinazione eme passiva. In questa tecnica, i globuli rossi rivestiti di antigene vengono preparati mescolando un antigene solubile con un globuli rossi che sono stati trattati con acido tannico o cloruro di cromo, entrambi i quali promuovono l’adsorbimento dell’antigene sulla superficie delle cellule. Tuttavia, è possibile rivestire gli eritrociti con un antigene solubile (ad es.. antigene virale, un polisaccaride o un aptene) e utilizzare i globuli rossi rivestiti in un test di agglutinazione per l’anticorpo all’antigene solubile.

Il siero diluito in serie che contiene l’anticorpo è caricato ad ogni pozzo del piatto del microtiter, dopo che i globuli rossi ricoperti antigene è applicato ad ogni pozzo. Il modello caratteristico dei globuli rossi agglutinati sui pozzetti viene utilizzato come strumento per analizzare le reazioni di agglutinazione. Se l’antigene è particolato, l’antigene può reagire con l’anticorpo nel siero e provoca l’aggregazione dell’antigene che mostra un risultato positivo.

Negli ultimi anni, c’è stato un passaggio dai globuli rossi alle particelle sintetiche, come le perle di lattice. La preparazione può essere utilizzata immediatamente o conservata per un uso successivo. L’uso di perline sintetiche offre i vantaggi di coerenza, uniformità e stabilità. Inoltre, le reazioni di agglutinazione che impiegano perline sintetiche possono essere lette rapidamente, spesso entro 3-5 minuti dalla miscelazione delle perle con il campione di prova. Sia sulla base di globuli rossi o le perle sintetiche più convenienti e versatili, reazioni di agglutinazione sono semplici da eseguire, non richiedono attrezzature costose, e rilevare piccole quantità di anticorpi ( concentrazioni a partire da nanogrammi per millilitro).

La fase iniziale del test è il collegamento tra la particella di lattice da parte delle molecole anticorpali che si attaccano specificamente ai determinanti antigenici sulla superficie delle particelle. C’è una formazione di grandi reticoli attraverso questi collegamenti trasversali e questi grandi reticoli sedimentano facilmente a causa delle grandi dimensioni dei ciuffi e sono visibili ad occhio nudo in pochi minuti. Il grado di agglutinazione può essere determinato tracciando la concentrazione aggutinante che dà una curva a forma di campana. I complessi antigene-anticorpo possono essere ingranditi usando le particelle di lattice. Molti dei test di agglutinazione del lattice vengono eseguiti manualmente e rilevati dall’osservazione visiva. Per determinare l’agglutinazione ci deve contenere circa 100 ciuffi, e questi ciuffi devono essere di circa 50 micrometri di dimensione per essere visto ad occhio.

Reazioni di inibizione dell’agglutinazione

Se l’anticorpo viene incubato con l’antigene prima della miscelazione con il lattice, l’agglutinazione viene inibita; questo perché non sono disponibili anticorpi liberi per l’agglutinazione. Nell’inibizione dell’agglutinazione, l’assenza di agglutinazione è diagnostica dell’antigene, fornisce un saggio ad alta sensibilità per piccole quantità di antigene. Per esempio i corredi domestici di gravidanza contengono la gonadotropina corionica umana (ormone di HCG) ha ricoperto la particella del lattice e l’anticorpo a HCG. Una donna incinta urina contiene HCG che viene secreto dalla placenta in via di sviluppo dopo la fecondazione. L’aggiunta di urina contenente HCG, inibisce l’agglutinazione delle particelle di lattice quando viene aggiunto l’anticorpo anti-HCG; e quindi la gravidanza è indicata dall’assenza di agglutinazione.

Le particelle di lattice

Polimerizzazione in emulsione è la procedura che viene applicata per la preparazione di particelle di lattice. In primo luogo lo stirene è mescolato con il tensioattivo (sodio dodecil solfato) soluzione, forma un miliardi di micelle emulsionate che sono in diametro uniforme. Quindi viene aggiunta una piccola quantità di persolfato di potassio che è un iniziatore di polimerizzazione solubile in acqua. Al termine del processo di polimerizzazione, le catene di polistirene sono disposte nelle micelle. La parte idrocarburica della catena di polistirene è attaccata al centro e lo terminal solfato terminale alla superficie delle sfere che è esposta alla fase acquosa. Altri idrocarburi e suoi derivati sono utilizzati anche per la produzione delle particelle di lattice uniformi, alcuni degli esempi sono stryrene-dlvinylbenzene, polimetilmetacrilato, stirene vinil toluene, polivinil toluene ecc.

Il processo di produzione di particelle di lattice è evoluto dalla produzione di gomma sintetica e anche l’emulsione ha un aspetto lattiginoso, il termine lattice è dato ad esso .Il diametro desiderato della particella di lattice può essere realizzato modificando il processo di preparazione, gli idrocarburi, i tensioattivi e l’iniziatore. La dimensione delle particelle di lattici sono di solito varia tra 0,05 µm a 2µm. A causa della presenza di ioni solfato e solfonato sulla superficie della particella che fornisce una carica superficiale negativa intrinseca alla particella.

Le particelle di lattice possono essere funzionalizzate e trattate in superficie per facilitare la stabilità di legame e per aumentare il fissaggio dell’analita. Trattamenti funzionali come ammidazione, amminazione, carbossilazione, idrossilazione e persino magnetizzazione vengono utilizzati per aumentare le proprietà delle particelle di lattice. Inoltre i vari colori delle particelle del lattice sono disponibili commercialmente che facilitano la lettura visiva.

Il test di agglutinazione al lattice è un metodo clinico per rilevare determinati antigeni o anticorpi in una varietà di fluidi corporei come sangue, saliva, urina o liquido cerebrospinale. Il campione da testare viene inviato al laboratorio e dove viene miscelato con perline di lattice rivestite con un antigene o anticorpo specifico. L’aggregazione di perline di lattice (agglutinazione) indica la presenza di particelle sospette.

Test di agglutinazione del lattice include alcuni dei vantaggi .Lo sono,

1. Capacità di ottenere risultati semi quantitativi.
2. Un costo di prova individuale basso.
3. Tempo relativamente breve per ottenere risultati.

Eseguendo diluizioni da 2 a 10 volte di provini possiamo ottenere i risultati semi quantitativi .Il test di agglutinazione al lattice presenta anche alcuni svantaggi che includono

1.È necessario interpretare attentamente i risultati marginali e
2. Problemi con specificità dovuti a sostanze interferenti in molti saggi.