Proteinasi K
Attivato dal calcio, l’enzima digerisce le proteine preferenzialmente dopo amminoacidi idrofobi (amminoacidi alifatici, aromatici e altri idrofobi). Sebbene gli ioni di calcio non influenzino l’attività enzimatica, contribuiscono alla sua stabilità.Le proteine saranno completamente digerite se il tempo di incubazione è lungo e la concentrazione di proteasi abbastanza alta. Dopo la rimozione degli ioni di calcio, la stabilità dell’enzima è ridotta, ma l’attività proteolitica rimane. La proteinasi K ha due siti di legame per Ca2+, che si trovano vicino al centro attivo, ma non sono direttamente coinvolti nel meccanismo catalitico. L’attività residua è sufficiente per digerire le proteine, che di solito contaminano i preparati di acido nucleico. Pertanto, la digestione con Proteinasi K per la purificazione degli acidi nucleici viene solitamente eseguita in presenza di EDTA (inibizione di enzimi dipendenti dagli ioni metallici come le nucleasi).
La proteinasi K è anche stabile su un ampio intervallo di pH (4-12), con un pH ottimale di pH 8.0.Un innalzamento della temperatura di reazione da 37 ° C a 50-60 °C può aumentare l’attività più volte, come l’aggiunta di 0,5-1% dodecil solfato di sodio (SDS) o cloruro di Guanidinio (3 M), tiocianato di guanidinio (1 M) e urea (4 M). Le condizioni sopra menzionate migliorano l’attività della proteinasi K rendendo più accessibili i siti di scissione del substrato. Temperature superiori a 65 °C, l’acido tricloroacetico (TCA) o gli inibitori della proteasi della serina AEBSF, PMSF o DFP inibiscono l’attività. La proteinasi K non sarà inibita da cloruro di guanidinio, tiocianato di guanidinio, urea, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrato, acido iodoacetico, EDTA o da altri inibitori della proteasi della serina come il clorometilchetone Na-Tosyl-Lys (TLCK) e il clorometilchetone Na-Tosyl-Phe (TPCK).
Proteasi K attività comunemente utilizzato buffer
| Buffer (pH = 8.0, 50 °C, da 1,25 µg/mL proteasi K, 15 min di incubazione) | Proteinasi K attività (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris·Cl | 100 |
| 30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; Lo 0,5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA, 5% di Tween 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; SDS 0,5% | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM di NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0.45% Tween 20; Lo 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM di EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 mm EDTA; 1% SDS | 203 |