Purificazione delle proteine
La scelta di un materiale di partenza è fondamentale per la progettazione di un processo di purificazione. In una pianta o un animale, una particolare proteina di solito non è distribuita in modo omogeneo in tutto il corpo; diversi organi o tessuti hanno concentrazioni più alte o più basse della proteina. L’uso di solo i tessuti o gli organi con la più alta concentrazione diminuisce i volumi necessari per produrre una data quantità di proteina purificata. Se la proteina è presente in bassa abbondanza, o se ha un alto valore, gli scienziati possono utilizzare la tecnologia del DNA ricombinante per sviluppare cellule che produrranno grandi quantità della proteina desiderata (questo è noto come sistema di espressione). L’espressione ricombinante consente alla proteina di essere etichettata, ad esempio da un His-tag o Strep-tag per facilitare la purificazione, riducendo il numero di passaggi di purificazione richiesti.
Una purificazione analitica utilizza generalmente tre proprietà per separare le proteine. In primo luogo, le proteine possono essere purificate secondo i loro punti isoelettrici facendole scorrere attraverso un gel classificato con pH o una colonna di scambio ionico. In secondo luogo, le proteine possono essere separate secondo la loro dimensione o peso molecolare via la cromatografia di esclusione di dimensione o dall’analisi di SDS-PAGE (elettroforesi del gel del dodecil solfato-poliacrilammide del sodio). Le proteine vengono spesso purificate utilizzando la pagina 2D e vengono quindi analizzate mediante impronte digitali di massa peptidica per stabilire l’identità proteica. Questo è molto utile per scopi scientifici e i limiti di rilevazione per le proteine sono al giorno d’oggi molto bassi e quantità di nanogrammi di proteine sono sufficienti per la loro analisi. In terzo luogo, le proteine possono essere separate per polarità/idrofobicità tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni o cromatografia a fase inversa.
Di solito un protocollo di purificazione delle proteine contiene uno o più passaggi cromatografici. La procedura di base in cromatografia consiste nel far scorrere la soluzione contenente la proteina attraverso una colonna imballata con vari materiali. Diverse proteine interagiscono in modo diverso con il materiale della colonna e possono quindi essere separate dal tempo necessario per passare la colonna o dalle condizioni necessarie per eluire la proteina dalla colonna. Di solito le proteine vengono rilevate mentre si staccano dalla colonna per la loro assorbanza a 280 nm. Esistono molti metodi cromatografici differenti:
Cromatografia di esclusione di dimensioneedit
La cromatografia può essere utilizzata per separare la proteina in soluzione o in condizioni di denaturazione utilizzando gel porosi. Questa tecnica è conosciuta come cromatografia di esclusione di dimensione. Il principio è che le molecole più piccole devono attraversare un volume più grande in una matrice porosa. Di conseguenza, le proteine di un certo intervallo di dimensioni richiedono un volume variabile di eluente (solvente) prima di essere raccolte all’altra estremità della colonna di gel.
Nel contesto della purificazione delle proteine, l’eluente viene solitamente raggruppato in diverse provette. Tutte le provette che non contengono tracce misurabili della proteina da purificare vengono scartate. La soluzione rimanente è quindi costituita dalla proteina per purificare e da qualsiasi altra proteina di dimensioni simili.
Separazione basata su carica o idrofobicità
Cromatografia di interazione idrofobica
I media HIC sono anfifilici, con regioni sia idrofobiche che idrofile, consentendo la separazione delle proteine in base alla loro idrofobicità superficiale. Le proteine bersaglio e le loro specie aggregate di prodotti tendono ad avere diverse proprietà idrofobiche e la loro rimozione tramite HIC purifica ulteriormente la proteina di interesse. Inoltre, l’ambiente utilizzato impiega tipicamente condizioni di denaturazione meno dure rispetto ad altre tecniche di cromatografia, contribuendo così a preservare la proteina di interesse nel suo stato nativo e funzionale. In acqua pura, le interazioni tra la resina e le regioni idrofobiche della proteina sarebbero molto deboli, ma questa interazione è migliorata applicando un campione di proteine alla resina HIC in tampone ad alta resistenza ionica. La forza ionica del tampone viene quindi ridotta a proteine eluttrici in ordine di idrofobicità decrescente.
Cromatografia a scambio ionicomodifica
La cromatografia a scambio ionico separa i composti in base alla natura e al grado della loro carica ionica. La colonna da utilizzare viene selezionata in base al tipo e alla forza di carica. Le resine a scambio anionico hanno una carica positiva e sono utilizzate per trattenere e separare i composti caricati negativamente (anioni), mentre le resine a scambio cationico hanno una carica negativa e sono utilizzate per separare le molecole caricate positivamente (cationi).
Prima che inizi la separazione, un tampone viene pompato attraverso la colonna per equilibrare gli ioni carichi opposti. Dopo l’iniezione del campione, le molecole di soluto si scambieranno con gli ioni tampone mentre ciascuna compete per i siti di legame sulla resina. La lunghezza di ritenzione per ogni soluto dipende dalla forza della sua carica. I composti più debolmente caricati elutteranno per primi, seguiti da quelli con cariche successivamente più forti. A causa della natura del meccanismo di separazione, il pH, il tipo di buffer, la concentrazione del buffer e la temperatura svolgono tutti ruoli importanti nel controllo della separazione.
La cromatografia a scambio ionico è uno strumento molto potente per l’uso nella purificazione delle proteine ed è frequentemente utilizzata sia nelle separazioni analitiche che preparative.
Elettroforesi a flusso liberomodifica
L’elettroforesi a flusso libero (FFE) è una tecnica di elettroforesi priva di vettori che consente la separazione preparativa delle proteine in un flusso tampone laminare utilizzando un campo elettrico ortogonale. Facendo uso di un gradiente di pH, che può ad esempio essere indotto dagli anfoliti, questa tecnica permette di separare le isoforme proteiche fino ad una risoluzione di < 0,02 delta-pI.
Cromatografia affinitàmodifica
La cromatografia di affinità è una tecnica della separazione basata sulla conformazione molecolare, che utilizza frequentemente le resine specifiche dell’applicazione. Queste resine hanno leganti attaccati alle loro superfici che sono specifici per i composti da separare. Più frequentemente, questi ligandi funzionano in modo simile a quello delle interazioni anticorpo-antigene. Questa” serratura e chiave ” misura fra il legante ed il suo composto dell’obiettivo lo rende altamente specifico, generante frequentemente un singolo picco, mentre tutto il resto nel campione è unretained.
Molte proteine di membrana sono glicoproteine e possono essere purificate mediante cromatografia ad affinità di lectina. Le proteine detersivo-solubilizzate possono essere permesse legarsi ad una resina della cromatografia che è stata modificata per avere una lectina covalentemente attaccata. Le proteine che non si legano alla lectina vengono lavate via e quindi le glicoproteine specificamente legate possono essere eluite aggiungendo un’alta concentrazione di uno zucchero che compete con le glicoproteine legate nel sito di legame della lectina. Alcune lectine hanno un legame ad alta affinità con gli oligosaccaridi delle glicoproteine che è difficile competere con gli zuccheri e le glicoproteine legate devono essere rilasciate denaturando la lectina.
Cromatografia di immunoaffinitàmodifica
La cromatografia di immunoaffinità utilizza il legame specifico di un antigene anticorpo per purificare selettivamente la proteina bersaglio. La procedura prevede l’immobilizzazione di una proteina su un substrato solido (ad esempio un cordone poroso o una membrana), che quindi lega selettivamente il bersaglio, mentre tutto il resto scorre attraverso. La proteina bersaglio può essere eluita cambiando il pH o la salinità. Il ligando immobilizzato può essere un anticorpo (come l’immunoglobulina G) o può essere una proteina (come la proteina A). Poiché questo metodo non comporta l’ingegneria in un tag, può essere utilizzato per proteine da fonti naturali.
Purificazione di una proteina etichettataedit
Un altro modo per etichettare le proteine è quello di progettare un tag peptidico antigene sulla proteina, e quindi purificare la proteina su una colonna o incubando con una resina sciolta che è rivestita con un anticorpo immobilizzato. Questa particolare procedura è nota come immunoprecipitazione. L’immunoprecipitazione è perfettamente in grado di generare un’interazione estremamente specifica che di solito si traduce nel legare solo la proteina desiderata. Le proteine etichettate purificate possono quindi essere facilmente separate dalle altre proteine in soluzione e successivamente elutizzate in soluzione pulita.
Quando i tag non sono più necessari, possono essere scissi da una proteasi. Ciò comporta spesso l’ingegneria di un sito di scissione della proteasi tra il tag e la proteina.
HPLCEdit
La cromatografia liquida ad alte prestazioni o cromatografia liquida ad alta pressione è una forma di cromatografia che applica un’alta pressione per guidare i soluti attraverso la colonna più velocemente. Ciò significa che la diffusione è limitata e la risoluzione è migliorata. La forma più comune è HPLC “a fase inversa”, in cui il materiale della colonna è idrofobo. Le proteine sono eluite da un gradiente di quantità crescenti di un solvente organico, come l’acetonitrile. Le proteine eluiscono secondo la loro idrofobicità. Dopo la purificazione da HPLC la proteina è in una soluzione che contiene solo composti volatili e può essere facilmente liofilizzata. La purificazione dell’HPLC provoca spesso la denaturazione delle proteine purificate e quindi non è applicabile alle proteine che non si ripiegano spontaneamente.