Tirosinasi
8.14.2.2.4 Tirosinasi (CE 1.14.18.1) e catecolo ossidasi (CE 1.10.3.1)
Tirosinasi, che appartiene ad una famiglia di proteine di avere la marmitta centrale formata da diciclici di tipo 3 di rame, catalizza la orthohydroxylation di monophenol e la successiva ossidazione del diphenolic prodotto risultante chinone.178 Una serie di reazioni si verifica sotto la concomitante riduzione dell’ossigeno molecolare in acqua. Il prodotto del chinone è un precursore reattivo per la sintesi dei pigmenti della melanina. La tirosinasi, che è contenuta in verdure, frutta e funghi, è un enzima chiave nella doratura che si verifica dopo lividi o conservazione a lungo termine. Nei mammiferi, l’enzima è responsabile di anomalie della pigmentazione della pelle, come macchie e difetti.179 Pertanto, la tirosinasi è piuttosto significativa nei settori dell’agricoltura e dell’industria. Nell’industria cosmetica, lo sviluppo e lo screening di potenti inibitori della tirosinasi sono particolarmente attraenti.
La tirosinasi è classificata nella famiglia delle proteine del rame di tipo 3, così come la catecol ossidasi e l’emocianina del pigmento respiratorio. Durante la reazione catalitica, il centro di rame di tipo 3 della tirosinasi esiste in tre forme redox.178 La forma deossi (Cu (I)–Cu(I)) è una specie ridotta, che lega l’ossigeno per dare la forma ossi (Cu(II) – O22 C Cu(II)). Nella forma ossi, l’ossigeno molecolare è legato come perossido in una modalità di bridging laterale μ-η2:η2, che destabilizza il legame O–O e lo attiva. La forma met (Cu (II) – Cu(II)) è assunta come forma enzimatica a riposo, dove gli ioni Cu(II) sono normalmente collegati a un piccolo ligando, come una molecola d’acqua o uno hydroxide idrossido.
La catecol ossidasi ossida l’orto-difenoli ai chinoni corrispondenti ma manca di attività monoossigenasi o cresolasi. L’emocianina agisce come vettore di ossigeno negli artropodi e nei molluschi.
Sono state determinate le strutture cristalline della tirosinasi da Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 e della catecol ossidasi dalla patata dolce Ipomoea batatas180. Confermano che il coordinamento del sito di rame di tipo 3 nella tirosinasi e nella catecol ossidasi è molto simile a quello trovato nell’emocianina. Questo era stato dedotto prima dalla somiglianza delle proprietà spettroscopiche e da un confronto di molte strutture primarie di tirosinasi ed emocianina.181-183 Sulla base della fonte biologica delle proteine è stato possibile identificare sette diverse organizzazioni di dominio. Le catecol ossidasi vegetali di diversi organismi hanno un’identità di sequenza di circa il 40-60%. L’identità di sequenza tra catecol ossidasi e emocianine mulluscan è di circa il 35% su quasi tutta la lunghezza delle sequenze. Al contrario, l’identità di sequenza tra le catecol ossidasi vegetali e altre proteine di rame di tipo 3 provenienti da qualsiasi fonte non vegetale è limitata alle due regioni di legame del rame.
Le due regioni che legano il rame mostrano la massima conservazione in tutte le proteine di rame di tipo 3. Soprattutto la regione legante CuB è altamente conservato, mentre la regione CUA-legante mostra più varietà di sequenza ed è stato ritenuto responsabile per le diverse funzioni di tirosinasi, catecol ossidasi, ed emocianina.
La struttura complessiva della tirosinasi da S. castaneoglobisporus in complesso con cornice di lettura aperta ORF378 viene visualizzato in Figura 23. La tirosinasi assume strutture α-elicoidali con il nucleo dell’enzima, che è formato da un fascio a quattro eliche. Il centro di rame dinucleare catalitico è alloggiato nel fascio elicoidale (Figura 23). Ciascuno dei due ioni di rame in un sito attivo è coordinato da tre residui His (Figura 24), che derivano dalle quattro eliche del fascio α tranne His54. Uno copper di rame (designato CuA) è coordinato da His38, His54 e His63. His38 e His63 si trovano rispettivamente nel mezzo di α2 e α3. Il secondo copper di rame (CuB) è coordinato da His190, His194 e His216. I residui His190 e His194 sono all’inizio e nel mezzo di α6, rispettivamente, e His216 è nel mezzo di α7. Questo centro dicopper si trova nella parte inferiore della grande concavità come una tasca di legame del substrato putativo, che è formata dai residui idrofobici. Oltre alla struttura elicoidale, la tirosinasi ha alcune strutture β, come giudicato dagli angoli di torsione della spina dorsale. In questi, solo i trefoli β-N e C-terminali formano una struttura in fogli.
Figura 23. Diagramma a nastro di tirosinasi da Streptomyces castaneoglobisporus in complesso con ORF378 (PDB-codice: 1WX3). Tirosinasi e ORF378 sono mostrati rispettivamente in rosa e lampone. Gli ioni rame CuA e CuB sono raffigurati come sfere gialle; preparati con PyMOL (WL DeLano, Palo Alto, 2003).
Figura 24. La forma met del centro attivo della tirosinasi da Streptomyces castaneoglobisporus (PDB-codice: 1WX3); preparato con PyMOL (WL DeLano, Palo Alto, 2003).
Sebbene la sequenza aminoacidica della tirosinasi abbia solo il 25,3 e il 26,0% di identità con quelle del catecolo ossidase180 I. batatas e il dominio odg del polpo dofleini hemocyanin,184 rispettivamente, la sua struttura complessiva è abbastanza simile alla loro. Tra queste tre proteine, si osserva un alto grado di conservazione nel dominio del nucleo composto dal fascio α. La tirosinasi e le emocianine di Panulirus interruputus185 e L. polyphemus66 non mostra alcuna omologia significativa e nessuna somiglianza nelle loro strutture, ma i domini del nucleo catalitico di queste proteine sono sovrapponibili.
Per la tirosinasi da S. castaneoglobisporus cinque diversi stati del sito attivo potrebbero essere caratterizzati in strutture cristalline, vale a dire, forma libera da rame, forma met I, forma met II, deossi e ossi. Nelle strutture cristalline della catecol ossidasi di I. batatas sono stati chiariti gli stati met e deossi e un complesso inibitore. Nello stato met (Cu (II), Cu (II)) i due ioni rameici sono a una distanza di 2.9 Å, ciascuno coordinato da tre istidine. Sono colmati da un altro atomo, molto probabilmente uno ion idrossido, ad una distanza di circa 1,8 Å da ogni ion rameico, in modo che ognuno di essi abbia un numero di coordinazione di 4 (vedi Figura 24, che mostra la stessa situazione per la tirosinasi di S. castaneoglobisporus). Nello stato deossi o ridotto, entrambi gli atomi di rame sono nello stato di ossidazione + 1. La distanza rame-rame è 4,4 Å. I numeri di coordinazione sono 4 per CuA (tre ligandi dell’istidina e una molecola d’acqua coordinante) e 3 per CuB (tre ligandi dell’istidina). La sfera di coordinazione è distorta piramidale trigonale per CuA e planare quadrata per CuB (il sito di coordinazione occupato dal ponte OH− nello stato met è vacante). Nel complesso inibitore con feniltiourea (PTU), la distanza rame–rame aumenta a 4,2 Å con l’atomo di zolfo di PTU che sostituisce il ponte idrossido dello stato met. Le sfere di coordinamento dei due coppers rimangono simili a quelle dello stato met, ma ci sono cambiamenti conformazionali nei residui del sito attivo. Il cambiamento più significativo è una rotazione dell’anello aromatico di Phe261 (numerazione catecol ossidasi).
Rispetto allo stato met, i residui di coordinamento hanno solo posizioni leggermente diverse nello stato ridotto, indicando una tasca piuttosto rigida. I cambiamenti di coordinazione sono associati ai movimenti degli atomi di rame nella tasca. Il complesso inibitore mostra che Phe261 si trova sopra il sito attivo come un cancello, che ruota dopo che l’inibitore è legato. Pertanto, l’accesso del substrato al centro metallico catalitico sembra essere controllato da questo “residuo di gate”.
Il meccanismo catalitico della tirosinasi è stato studiato in dettaglio da Solomon et al.178 Solomon ha proposto un meccanismo per entrambe le attività della cresolasi e della catecolasi della tirosinasi (Figura 25). Questo meccanismo suggerisce che lo stato ossi sia il punto di partenza dell’attività della cresolasi (cerchio interno). Questo stato è presente nella forma a riposo della tirosinasi in una proporzione di circa il 15% (stato met dell ‘ 85%). Un substrato monofenolo si lega allo stato ossi ed è monoossigenato a o-difenolo. Questo difenolo si lega successivamente al centro di rame della tirosinasi met in una modalità di legame bidentato proposta sulla base di un composto modello.188 L’ossidazione del substrato di difenolo porta allo stato ridotto del centro di rame dinucleare. La riossidazione dello stato ridotto allo stato ossi avviene per attacco di diossigeno e chiude il ciclo catalitico.
Figura 25. Meccanismo di cresolasi e catecolasi attività della tirosinasi e catecol ossidasi sviluppato sulla base di una proposta iniziale di Solomon e coworkers178 e includendo risultati più recenti.186,187 Riprodotto da C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chimica. Res. 2002, 35, 183-191, con il permesso dell’American Chemical Society.
Il meccanismo dell’attività delle catecolasi (cerchio esterno) inizia dagli stati ossi e met. Un substrato di difenolo si lega allo stato met (ad esempio), seguito dall’ossidazione del substrato al primo chinone e dalla formazione dello stato ridotto dell’enzima. Il legame del diossigeno porta allo stato ossi, che viene successivamente attaccato dalla seconda molecola di difenolo. L’ossidazione al secondo chinone forma nuovamente lo stato met e chiude il ciclo catalitico.
I meccanismi di reazione alternativi includono un meccanismo radicale proposto da Kitajima e Morooka189 e un meccanismo che coinvolge un intermedio Cu(III) basato su misurazioni di composti modello.190 Sulla base della struttura cristallina del complesso inibitore catecol ossidasi–PTU, è stato suggerito il legame monodentato del substrato per la catecol ossidasi.180 Un meccanismo radicale, come proposto per la debole attività della catecolasi trovata nell’emocianina di Octopus vulgaris,191 è anche possibile per la catecol ossidasi a causa della forte relazione strutturale tra catecol ossidasi da I. batatas e odg emocianina come descritto sopra.
La netta differenza tra catecol ossidasi e tirosinasi non è stata ancora spiegata. Una fase di ritardo nell’attività monofenolasi della tirosinasi è stata trovata e studiata e si propone di essere il risultato di un’inibizione temporanea dello stato met della tirosinasi per eccesso del substrato monofenolico (Figura 25).186 L’attività della monofenolasi aumenta quando il prodotto difenolo sposta il monofenolo dalla tirosinasi met e consente la continuazione del ciclo catalitico. La catecol ossidasi nella sua forma isolata è presente esclusivamente nello stato met ed è anche inibita dal fenolo. È stato quindi suggerito che la mancanza dello stato ossi è la ragione per cui la catecol ossidasi manca dell’attività della cresolasi. Poiché l’ossicatecolo ossidasi non mostra alcuna attività monoossigenasica, questa spiegazione non sembra del tutto soddisfacente. Un’altra possibile ragione è che l’accesso al CuA, che è stato proposto per essere necessario per l’ossigenazione dei monofenoli,192 è bloccato nella struttura cristallina della catecol ossidasi da I. batatas.