Tossina di clostridium difficile B
Quando il residuo catalitico della treonina della glucosiltransferasi disattiva una famiglia di piccole GTPASI,ad esempio la famiglia Rho; Rac e Cdc42 all’interno delle cellule bersaglio disturbano i meccanismi di trasduzione del segnale, che porta al disfunzionamento del citoscheletro di actina, alla giunzione cellula-cellula e all’apoptosi (Fig. 5). Rho induce l’attività delle fibre di stress di actina. Rac proteine controlla le attività di membrana ruffling e NADPH-ossidasi neutrofili. Cdc42 regola la formazione di filamenti di F-actina nei filopodi.
Citotossicitàmodifica
Figura 3: La tossina B cambia la dinamica della struttura cellulare. Immagini di SEM: a) cellule di controllo e b) cellule trattate con TcdB per 18 ore. Freccia nera indica la posizione della superficie cellulare blebbing.
Diversi studi hanno dimostrato che la presenza di TcdB nelle cellule di mammifero porta a rapidi cambiamenti all’interno della morfologia cellulare e della segnalazione cellulare. Entro un breve periodo di tempo, le cellule hanno l’aspetto di placca con piccoli dosaggi di TcdB e TcdA. Inoltre, la morte delle cellule è un importante impatto di queste tossine dopo che le cellule sono state intossicate. Un’indagine di Donta et al., inoltrato che TcdB ha gravi impatti in altre cellule di mammifero come le cellule ovariche di criceto cinese, le cellule epiteliali cervicali umane, le cellule surrenali di topo, gli epatociti di ratto e gli astrociti di ratto (Fig.3).
L’attività citotossica si basa su tipi di cellule, che potrebbero variare da 4 volte a 200 volte. Generalmente, quando le cellule sono infette da TcdB, non solo perdono la loro integrità strutturale, ma anche diminuzioni dei filamenti di F-actina. Gli arrotondamenti cellulari di TcdB non richiedono più di 2 ore (Fig. 4), ma per quanto riguarda la morte cellulare va, può richiedere circa 24 ore. Per quanto riguarda la diarrea associata al clostridium difficile (CDAD), gli effetti della citopaticità sono più critici della morte cellulare reale perché una volta che le cellule perdono l’integrità del filamento di actina del citoscheletro, perdono anche la sua normale funzione.
Figura 4: Effetti della tossina B sugli astrociti di ratto. Questa è una probabile illustrazione di astrociti di ratto incubati con 100 ng/ml di tossina B per 2 ore a 37 °C.
Effetti su piccole GTPasesEdit
La causa dell’attività citotossica da parte del TcdB all’interno della cellula ospite è principalmente mediata dall’endocitosi del recettore. Gli endosomi acidi consentono alla tossina B di entrare nel citosol. Questo fenomeno avviene da una regione del recettore legante, che consente alla tossina di entrare nelle cellule ospiti. Attraverso l’accessibilità del citosol delle cellule ospiti, TcdB disattiva le piccole GTPASI (Fig. 5), ad esempio i membri della famiglia Rho Rac e Cdc42 dal processo di glicosilazione della treonina 35 in Cdc42 e Rac e della treonina 37 in Rho. Queste Rho GTPASI si trovano ubiquitamente nel citosol delle cellule eucariotiche responsabili dell’organizzazione del citoscheletro di actina perché le tossine nel citosol causano la condensazione dei filamenti di actina come conseguenza dell’arrotondamento cellulare e del blebbing della membrana (Fig. 3), che alla fine porta all’apoptosi. TcdB provoca cambiamenti critici alla dinamica cellulare e morfologia. La figura 3 mostra il probabile effetto della tossina B sulla superficie di una cellula; blebbing della membrana (frecce nere). Inoltre, TcdB inattiva Rho GTPases. Di conseguenza, le giunzioni cellula-cellula vengono interrotte, il che aumenta la permeabilità epiteliale della tossina B e l’accumulo di liquidi nel lume. Questo è uno dei principali agenti causali nel contrarre la diarrea associata al clostridium difficile (CDAD) (Fig. 5).
Figura 5: modificazioni intracellulari di TcdB. In primo luogo, la tossina B si lega alla superficie della cellula ed è interiorizzata dall’endocitosi mediata dal recettore. In secondo luogo, l’acidificazione dell’endosoma innesca la formazione di un poro attraverso il quale viene traslocato il GTD. In terzo luogo, l’assorbimento da UDP-glucosio aiuta a legarsi alle GTPASI e rilasciare nel citosol. Infine, le GTD glucosilano le GTPASI della famiglia Rho sulla membrana cellulare e controllano la regolazione della trascrizione e, in definitiva, l’apoptosi della cellula.
Inoltre, il tasso di idrolisi da TcdB di UDP-glucosio è circa cinque volte maggiore di TcdA. Diversi studi hanno indicato che Rho presenta una modifica posttranslazionale attraverso la prenilazione e la carbossimetilazione, che si verifica nel lato citoplasmatico della membrana plasmatica, quindi lo scambio di GTP in GDP. Quando TcdB si lega a Rho e ad altre piccole GTPASI, GTP si idrolizza in GDP, che porta a GTP-bound (attivo) a GDP-bound (inattivo) (Fig. 5). Inoltre, questa attività di interscambio è regolata da fattori di guanina nel citosol della cellula.
Disturbo sui percorsi del segnalemodifica
La regolazione cellulare di Rho, Rac e Cdc42 ha effetti al di fuori delle vicinanze dei filamenti di actina del citoscheletro (Fig. 4), Queste piccole GTPASI sono incorporate nel ciclo cellulare che regola i segnali tramite chinasi proteico-chinasi attivate da mitogeno (MAPKKs). Alcune parti fisiologiche delle cellule che non sono coinvolte nei filamenti di actina, non possono causare l’arrotondamento cellulare o la morte cellulare subito, ma nell’attività della via a valle, possono portare al deterioramento dei filamenti di actina e, infine, alla morte cellulare.
Nel 1993, uno studio condotto da Shoshan et al., ha mostrato che le cellule con TcdB hanno cambiato l’attività della fosfolipasi A2. Questo è stato un evento indipendente dalla rottura del citoscheletro di actina. Shoshan et al., inoltre ha indicato che TcdB ha inibito l’attività di segnalazione del ricevitore disattivando le proteine di Rho via la fosfolipasi D.
Poro formationEdit
TcdB accede all’interno della cellula attraverso endocitosi clatrina-mediata, Quando la tossina B fa parte del citosol, la glucosiltransferasi passa attraverso la membrana endosomal, che diminuisce il pH, induce la traslocazione e, infine, conduce a cambiamenti morfologici di traslocazione regione residui (958-1130). Le regioni idrofobiche sono incastonate nella membrana ospite per formare i pori che permettono ai domini della glucosiltransferasi di passare attraverso. Quando le cellule sono infettate con TcdB in un ambiente acido, attenua le tossine e provoca riarrangiamenti di forma (Fig. 6). Come conseguenza del pH acido, TcdB mostra chiare differenze nella fluorescenza originale del triptofano, nella suscettibilità delle proteasi e nelle superfici idrofobiche. Un altro gruppo ha dimostrato che l’acidificazione porta a cambiamenti conformazionali della tossina e, cosa più importante, aiuta a formare i pori. Una regione di traslocazione putativa (Fig. 2) costituisce circa 801-1400 aminoacidi, di cui residui 958-1130 sono idrofobi e sono responsabili della formazione di pori transmembrana. La maggior parte degli studi ha utilizzato il ceppo TcdB 630 per mostrare l’attività di formazione dei pori delle tossine C. difficile.
Indotto da pHEdit
Per vedere se gli effetti della scissione proteolitica del TcdB avvengono sulla superficie cellulare o negli endosomi acidi, gli studi hanno utilizzato la Bafilomicina A1, che è nota per bloccare le H+-ATPasi di tipo V degli endosomi. Questo riduce l’acidità negli endosomi. La via fisiologica di assorbimento di TcdB impedisce l’attività citopatica da parte di TcdB. Quando le cellule erano in condizioni acide (pH 4.0) per 5 minuti dopo aver legato TcdB alla superficie cellulare a 37 gradi Celsius, sono stati osservati i riarrangiamenti e gli arrotondamenti della forma. Tuttavia, quando le cellule arrotondate sono state incubate per un’ora aggiuntiva a pH neutro (7,0) con parametri simili, non è stato osservato alcun arrotondamento delle cellule. Entrambi gli studi hanno dimostrato che la tossina B ha una proprietà di scissione proteolitica, che è fondamentale per l’accesso al citosol. Avere un pH dell’endosoma acido porta ad alterazioni topologiche del TcdB (Figura 6).
Figura 6: Dominio di organizzazione di TcdB.Mostrando la differenza tra pH neutro e acido (4).
Geneticamodifica
Il gene che codifica la proteina TcdB, tcdB, si trova all’interno della regione cromosomica di 19,6 kb. Questo è noto come locus of pathogenicity o PaLoc (Figura 2). L’open Reading frame (ORF) per tcdB ha una lunghezza di 7.098 nucleotidi. È importante ricordare che-oltre ai principali geni della tossina nella regione di PaLoc-ci sono altri tre geni accessori che codificano nella regione di PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) e tcdE nel mezzo. Questi geni aiutano a regolare l’espressione TcdA e TcdB. Aiutano anche a secernere o rilasciare le tossine dalla cellula. Il gene codificante tcdE, situato tra tcdB e tcdA, è analogo alle proteine holin, quindi, si suggerisce che tcdE funzioni come un gene facilitatore che migliora il rilascio o la secrezione di TcdA e TcdB aumentando di conseguenza la permeabilità della membrana cellulare ospite.
Figura 2: Locus di patogenicità archetipica (PaLoc), che codifica le grandi tossine clostridiali(LCT) coinvolte in C. infezioni difficili CDI.
Rilevamento delle tossineedit
Ci sono diverse dimensioni plasmidiche di C. difficile. I pesi molecolari rilevati vanno da 2, 7×106 a 100×106, ma le dimensioni del plasmide non mostrano alcuna correlazione con la tossicità. Al fine di rilevare il livello di tossina B in C. difficile, i medici utilizzano ampiamente saggi di coltura cellulare derivati da campioni di feci di pazienti con PMC. Il test di coltura cellulare è considerato un “gold standard” per rilevare la tossicità in C. difficile perché una piccola quantità di tossina B è in grado di causare l’arrotondamento delle cellule (Fig. 4), quindi, è un grande vantaggio dei laboratori clinici fare correlazioni con il CDAD causato da TcdB. Sebbene l’attività citotossica di grandi tossine clostridiali (LCTS) sia stata trovata in campioni di feci di pazienti PMC, l’attività della tossina B ha avuto effetti citotossici più dannosi rispetto alla tossina A. Pertanto, l’attività della tossina A è attenuata quando non è isolata dalla tossina B. La rilevazione della tossicità C. difficile è estremamente sensibile, tuttavia, utilizzando il test di coltura cellulare; l’uso di dosi fino a 1 pg / mL di tossina B è sufficiente per causare l’arrotondamento delle cellule. Questo è il principale vantaggio nell’utilizzo del test del tessuto di coltura per rilevare la tossicità nei pazienti PMC. Anche se i laboratori clinici hanno cercato di utilizzare un test microtiter plate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) e altre tecniche per rilevare l’attività citotossica della tossina B nelle feci dei pazienti PMC, i risultati non sono accurati come quelli in cui sono stati utilizzati saggi di coltura cellulare.
Fattore di produzionemodifica
Aggiungendo antimicrobici, ad es. clindamicina, nel terreno di coltura, studi hanno dimostrato che l’attività citotossica nelle colture di C. difficile aumenta di 4-8 volte. Inoltre, conoscendo il ruolo degli antibiotici sulle cause della PMC, molti studi precedenti si sono concentrati sugli effetti della produzione di antimicrobici di tossine. Di conseguenza, gli studi sono stati in grado di concludere che la natura subinibitoria dei livelli di vancomicina e penicillina stava aumentando la produzione di tossine nelle colture di C. difficile. Le quantità di produzione della tossina erano correlate con l’uso del mezzo di crescita per gli organismi. Un altro studio ha illustrato che gli alti livelli di produzione di tossine di TcdB sono stati osservati in mezzi complessi come il brodo di infusione del cervello e del cuore. Alti livelli di tossine sono stati prodotti con isolamento di altamente virulento. Al contrario, bassi livelli di tossine sono stati prodotti con isolamento di debolmente virulento. Quindi, mostra che le produzioni di tossine erano co-regolate. Sebbene il meccanismo alla base del coinvolgimento dell’ambiente nella modulazione dei segnali che esprimono le tossine non sia compreso, studi in vitro hanno dimostrato che l’espressione della tossina è rafforzata dalla repressione catabolita e dallo stress, ad esempio antibiotici. Un altro studio ha dimostrato che limitare la biotina in mezzo ben caratterizzato aumenta la produzione di TcdB di 64 volte e TcdA di 35 volte. Questo è stato fatto con C. difficile e dosi di biotina piccole come 0,05 nM. Diversi altri primi studi hanno sostenuto contro la teoria che la produzione di tossina ha nulla a che fare con lo stress o catabolite repressione di entrambi tossina TcdA o TcdB. Inoltre, molti studi dicono che la ragione principale delle differenze tra gli altri studi è dovuta alla produzione di tossine che non si verificano con tutti gli isolati di C. difficile.