タンパク質精製
精製プロセスの設計には、出発物質の選択が鍵となります。 植物や動物では、特定のタンパク質は通常、体全体に均一に分布していません。 最も高い濃度のティッシュか器官だけの使用はある特定の量の浄化された蛋白質を作り出すのに必要とされる容積を減らす。 蛋白質が低い豊富であれば、または高い価値があれば、科学者はたくさんの望ましい蛋白質を作り出す細胞を開発するのに組換えDNAの技術を使用す 組換え発現は、精製を容易にし、必要な精製工程の数を減少させるために、タンパク質を、例えば、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグによってタグ付けすることを可
分析精製は、一般的にタンパク質を分離するために三つの特性を利用する。 最初に、蛋白質はpHの等級別にされたゲルかイオン交換のコラムを通してそれらを動かすことによって等電ポイントに従って浄化されてもよい。 第二に、タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーまたはSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析によって、そのサイズ 蛋白質は頻繁に2Dページの使用によって浄化され、次に蛋白質の同一性を確立するためにペプチッド固まりの指紋によって分析されます。 これは科学的な目的のために非常に有用であり、蛋白質のための検出限界はこの頃は非常に低く、蛋白質のnanogram量は分析のために十分です。 第三に、タンパク質は、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを介して極性/疎水性によって分離され得る。
通常、タンパク質精製プロトコルには一つ以上のクロマトグラフ工程が含まれています。 クロマトグラフィーの基本的な手順は、タンパク質を含む溶液を様々な材料を充填したカラムに流すことです。 異なるタンパク質は、カラム材料と異なって相互作用し、カラムを通過するのに必要な時間、またはカラムからタンパク質を溶出するのに必要な条 通常、タンパク質は、280nmでの吸光度によってカラムから外れているときに検出されます。
サイズ排除クロマトグラフ編集
クロマトグラフィーは、多孔質ゲルを使用することにより、溶液または変性条件でタンパク質を分離するために使用することができる。 この手法は、サイズ排除クロマトグラフィーとして知られています。 原理は、より小さな分子が多孔質マトリックス中でより大きな体積を横断しなければならないことである。 結果的に、ある範囲のサイズのタンパク質は、ゲルのカラムの他端で収集される前に、可変体積の溶離液（溶媒）を必要とする。
タンパク質精製の文脈では、溶離液は通常、異なる試験管にプールされる。 浄化するために蛋白質の測定可能な跡を含んでいないすべての試験管は放棄されます。 したがって、残りの溶液は、精製するためのタンパク質および他の同様の大きさのタンパク質からなる。
電荷または疎水性に基づく分離edit
疎水性相互作用クロマトグラフedit
HIC媒体は両親媒性であり、疎水性および親水性の両方の領域を有し、表面疎水性に基づくタンパク質の分離を可能にする。 標的タンパク質とその生成物集合種は異なる疎水性特性を有する傾向があり、HICを介してそれらを除去することは、目的のタンパク質をさらに浄化 さらに、使用される環境は普通他のクロマトグラフィーの技術よりより少なく粗い変性の条件を用い、従って本来および機能状態の興味の蛋白質を保 純水中では，樹脂と蛋白質の疎水性領域との相互作用は非常に弱いが，この相互作用は高イオン強度緩衝液中のｈｉｃ樹脂に蛋白質試料を適用することによって増強される。 次に、緩衝液のイオン強度を低下させて、疎水性を減少させる順にタンパク質を溶出させる。
イオン交換クロマトグラフ編集
イオン交換クロマトグラフは、そのイオン電荷の性質と程度に応じて化合物を分離する。 使用されるカラムは、その種類と電荷の強さに応じて選択されます。 陰イオン交換樹脂は正電荷を有し、負に帯電した化合物（陰イオン）を保持して分離するために使用され、陽イオン交換樹脂は負電荷を有し、正に帯電した分子（陽イオン）を分離するために使用される。
分離が始まる前に、緩衝液がカラムを通ってポンピングされ、対向する荷電イオンが平衡化される。 サンプルの注入に、溶質の分子は緩衝イオンとそれぞれが樹脂の結合場所のために競うと同時に交換します。 各溶質の保持の長さは、その電荷の強さに依存する。 最も弱い電荷を帯びた化合物が最初に溶出し、続いてより強い電荷を持つ化合物が溶出する。 分離機構の性質のために、pH、緩衝剤の種類、緩衝剤の濃度、および温度はすべて分離を制御する上で重要な役割を果たす。
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質精製に使用するための非常に強力なツールであり、分析および分取の両方の分離に頻繁に使用されます。
フリーフロー電気泳動
フリーフロー電気泳動（FFE）は、直交電界を用いて層流バッファストリーム中の分取タンパク質分離を可能にするキャリアフリー電気泳動 例えば両性細胞によって誘導することができるpH勾配を利用することによって、この技術は、＜810＞0.02delta-pIの分解能までタンパク質アイソフォームを分
アフィニティークロマトグラフィーは、分子立体配座に基づく分離技術であり、用途に特化した樹脂を頻繁に利用 これらの樹脂は、分離される化合物に特異的な配位子をそれらの表面に付着させている。 最も頻繁には、これらのリガンドは、抗体-抗原相互作用のそれと同様の様式で機能する。 リガンドとその標的化合物との間のこの「ロックおよびキー」適合は、それを非常に特異的にし、頻繁に単一のピークを生成し、試料中の他のすべては未保持
多くの膜タンパク質は糖タンパク質であり、レクチン親和性クロマトグラフィーで精製することができる。 洗剤可溶化タンパク質は、共有結合性レクチンを有するように修飾されたクロマトグラフィー樹脂に結合させることができる。 レクチンに結合しないタンパク質は洗い流され、特異的に結合した糖タンパク質は、レクチン結合部位で結合した糖タンパク質と競合する高濃度の糖を添加することによって溶出することができる。 レクチンの中には糖と競合しにくい糖タンパク質のオリゴ糖との親和性が高く、結合した糖タンパク質はレクチンを変性させることによって放出される必要があるものもある。
イムノアフィニティクロマトグラフ
イムノアフィニティクロマトグラフィーは、抗体-抗原の特異的結合を使用して、標的タンパク質を選択的に この手順では、タンパク質を固体基質（例えば、多孔質ビーズまたは膜）に固定化し、それが選択的に標的に結合し、他のすべてが流れる。 標的タンパク質は、pHまたは塩分を変化させることによって溶出させることができる。 固定化されたリガンドは、抗体（免疫グロブリンＧなど）であり得るか、またはタンパク質（プロテインＡなど）であり得る。 この方法はタグ内の工学を伴わないので、天然源からのタンパク質に使用することができる。
タグ付きタンパク質の精製edit
タンパク質にタグを付ける別の方法は、抗原ペプチドタグをタンパク質上に操作し、カラム上または固定化抗体で被覆された緩い樹脂でインキュベートすることでタンパク質を精製することである。 この特定の手順は、免疫沈降として知られている。 免疫沈降は、通常、所望のタンパク質のみを結合する結果となる非常に特異的な相互作用を生成することが非常に可能である。 精製されたタグ付きタンパク質は、溶液中の他のタンパク質から容易に分離し、後できれいな溶液に溶出することができる。
タグが不要になると、プロテアーゼによって切断される可能性があります。 これは頻繁に札と蛋白質間のプロテアーゼの開裂の場所を設計することを含みます。
HPLCEdit
高速液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィーは、カラムを介して溶質をより速く駆動するために高圧を適用するクロマトグラフィーの一形態である。 これは、拡散が制限され、分解能が改善されることを意味する。 最も一般的な形態は、カラム材料が疎水性である「逆相」ＨＰＬＣである。 蛋白質はアセトニトリルのような有機溶剤の増加する量の勾配によって、溶離されます。 蛋白質は疎水性に従って溶出します。 HPLCによる精製後、タンパク質は揮発性化合物のみを含む溶液中にあり、容易に凍結乾燥することができる。 HPLC精製は、精製されたタンパク質の変性をもたらすことが多く、したがって、自発的に再形成されないタンパク質には適用できない。