チロシナーゼ
8.14.2.2.4チロシナーゼ(EC1.14.18.1)とカテコールオキシダーゼ(EC1.10.3.1)
チロシナーゼは、二核3型銅によって形成された触媒中心を有するタンパク質ファミリーに属し、チロシナーゼのオルトヒドロキシ化を触媒する。モノフェノールおよびその後のジフェノール生成物の得られたキノンへの酸化。178一連の反応は、分子酸素の水への付随する還元下で起こる。 キノン生成物は、メラニン色素の合成のための反応性前駆体である。 野菜、果物、キノコに含まれるチロシナーゼは、あざや長期保存時に発生する褐変の重要な酵素です。 哺乳動物では、この酵素は、斑点および欠陥などの皮膚色素沈着異常の原因である。179このように、チロシナーゼは農業および産業の分野で非常に重要である。 化粧品業界では、チロシナーゼの強力な阻害剤の開発とスクリーニングが特に魅力的です。
チロシナーゼは、カテコールオキシダーゼや呼吸色素ヘモシアニンと同様に、3型銅タンパク質ファミリーに分類される。 触媒反応の間、チロシナーゼの3型銅中心は三つの酸化還元形態で存在する。デオキシ形態（Ｃｕ（ｉ）−Ｃｕ（ｉ））は、酸素と結合してオキシ形態（Ｃｕ（Ｉ Ｉ）−Ｏ２ ２−Ｃｕ（Ｉ Ｉ））を与える還元種である。 Oxy形態では、分子酸素はo-O結合を不安定化し、それを活性化させるπ-π2:π2サイドオン架橋モードで過酸化物として結合される。 Ｍｅｔ形態（Ｃｕ（Ｉ Ｉ）−Ｃｕ（Ｉ Ｉ））は、Ｃｕ（Ｉ Ｉ）イオンが通常、水分子または水酸化物イオンのような小さな配位子に架橋される休止酵素形態として想定される。
カテコールオキシダーゼは、オルト-ジフェノールを対応するキノンに酸化するが、モノオキシゲナーゼまたはクレソラーゼ活性を欠く。 ヘモシアニンは節足動物および軟体動物の酸素キャリアとして機能します。
streptomyces castaneoglobisporus HUT620268由来のチロシナーゼとサツマイモIpomoea batatas180由来のカテコールオキシダーゼの結晶構造が決定されている。 彼らは、チロシナーゼとカテコールオキシダーゼにおける3型銅部位の配位が、ヘモシアニンに見られるものと非常に類似していることを確認した。 これは分光特性の類似性と多くのチロシナーゼとヘモシアニン一次構造の比較から以前に推定されていた。181-183タンパク質の生物学的供給源に基づいて、七つの異なるドメイン組織を同定することができます。 異なる生物の植物カテコールオキシダーゼは、約40-60％の配列同一性を有する。 カテコールオキシダーゼとムルスカンヘモシアニンとの間の配列同一性は、配列のほぼ全長にわたって約35％である。 対照的に、植物カテコールオキシダーゼと任意の非植物源からの他のタイプ-3銅タンパク質との間の配列同一性は、二つの銅結合領域に制限されている。
二つの銅結合領域は、すべてのタイプ3銅タンパク質を通じて最高の保存性を示しています。 CuA結合領域は、より多くの配列の多様性を示し、チロシナーゼ、カテコールオキシダーゼ、およびヘモシアニンの異なる機能のために責任が開催されているのに対し、特に領域結合CuBは、高度に保存されています。
sからのチロシナーゼの全体的な構造。 図23には、オープン読み取りフレームORF378を持つ複合体のcastaneoglobisporusが表示されています。 チロシナーゼは、酵素のコアとα-ヘリカル構造をとり、これは四ヘリックス束によって形成される。 触媒二核銅中心はらせん束に蓄えられている（図23）。 活性部位にある2つの銅イオンのそれぞれは、3つのHis残基によって配位されており(図24)、これらはhis54を除くα束の4つのヘリックスから誘導されています。 一つの銅イオン（cuaと呼ばれる）は、His38、His54、およびHis63によって配位されている。 His38とHis63は、それぞれα2とα3の中央に位置しています。 第二の銅イオン（CuB）は、His190、His194、およびHis216によって配位されている。 残基Ｈ Ｉ ｓ１ ９ ０およびＨ Ｉ ｓ１ ９ ４はそれぞれα６の開始位置および中間位置にあり、ｈ Ｉ Ｓ２ １ ６はα７の中間位置にある。 この二コッパー中心は、疎水性残基によって形成される推定基質結合ポケットとしての大きな凹みの底部に位置する。 チロシナーゼは、ヘリカル構造に加えて、骨格ねじり角から判断すると、いくつかのβ構造を有する。 これらでは、N末端およびC末端のβ鎖のみがシート構造を形成する。
図23. ORF378（PDBコード：1WX3）との複合体におけるStreptomyces castaneoglobisporusからのチロシナーゼのリボン図。 チロシナーゼとORF378は、それぞれピンクとラズベリーで示されています。 銅イオンＣｕａおよびＣｕｂは、Ｐｙｍｏｌを用いて調製された黄色の球として描かれている（Ｗ．
図24. Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のチロシナーゼの活性中心のｍｅｔ形態（ＰＤＢコード：１ＷＸ３）；Ｐｙｍｏｌを用いて調製した（Ｗ．
チロシナーゼのアミノ酸配列は、I.batatasカテコールオキシダーゼ180およびタコdofleiniヘモシアニンのodgドメイン184とわずか25.3および26.0％の同一性を有するが、その全体的な構造は彼らのものと非常に類似している。 これら三つのタンパク質のうち，α-バンドルからなるコアドメインには高度の保存が観察された。 Panulirus interruputus185およびLからのチロシナーゼおよびヘモシアニン。 polyphemus66は、それらの構造に有意な相同性および類似性を示さないが、これらのタンパク質の触媒コアドメインは重畳可能である。
S.castaneoglobisporus由来のチロシナーゼの活性部位の五つの異なる状態は、結晶構造、すなわち、銅フリーフォーム、metフォームI、metフォームII、デオキシ、およびオキシで特徴付け Ｉ．ｂａｔａｔａｓ由来のカテコールオキシダーゼの結晶構造において，ｍｅｔおよびデオキシ状態および阻害剤複合体を解明した。 Met状態（Cu（II）、Cu（II））では、2つの第二銅イオンは2の距離にある。9Å、それらのそれぞれは三つのヒスチジンによって調整されています。 これらは、それぞれの第二銅イオンから約1.8Åの距離で別の原子、おそらく水酸化物イオンによって架橋されているため、それぞれの配位数は4である（図24を参照）。 デオキシまたは還元状態では、両方の銅原子は+1酸化状態にある。 銅-銅距離は4.4Åである。 配位数はCuA（三つのヒスチジン配位子と配位水分子）では4、CuB（三つのヒスチジン配位子）では3である。 配位球はＣｕａでは三角錐状に歪んでおり，ｃｕｂでは正方形平面である（ｍｅｔ状態では橋渡しＯ ｈ−によって占有される配位部位は空いている）。 フェニルチオ尿素（PTU）との阻害剤複合体では、PTUの硫黄原子がmet状態のヒドロキシブリッジを置き換えると、銅–銅距離は4.2Åに増加する。 二つの銅の配位球はｍｅｔ状態の配座球と類似していたが，活性部位残基に配座変化があった。 最も重要な変化はPhe261（カテコールオキシダーゼ）の芳香環の回転である。
met状態と比較して、配位残基は還元状態でわずかに異なる位置しか持たず、かなり剛性のポケットを示しています。 配位の変化は、ポケット内の銅原子の動きに関連している。 阻害剤複合体は、Phe261が阻害剤が結合した後に回転するゲートのような活性部位の上に位置することを示している。 したがって、触媒金属中心への基板のアクセスは、この’ゲート残基’によって制御されるようである。
チロシナーゼの触媒機構は、Solomonらによって最初に詳細に研究された。178ソロモンは、チロシナーゼのクレソラーゼ活性とカテコラーゼ活性の両方のメカニズムを提案した（図25）。 この機構はオキシ状態がクレソラーゼ活性の出発点であることを示唆している（内側の円）。 この状態は、約１ ５％（８ ５％ｍｅｔ状態）の割合でチロシナーゼの休止形態で存在する。 モノフェノール基質はオキシ状態に結合し、o-ジフェノールにモノオキシゲン化される。 このジフェノールはその後，モデル化合物に基づいて提案された二座結合モードでｍｅｔチロシナーゼの銅中心に結合する。188ジフェノール基板の酸化は、二核銅中心の還元状態をもたらす。 還元状態のオキシ状態への再酸化は二酸素の攻撃によって起こり，触媒サイクルを閉じる。
図25. チロシナーゼおよびカテコールオキシダーゼのクレソラーゼおよびカテコラーゼ活性のメカニズムは、Solomonおよびcoworkers178による最初の提案に基づいて開発され、より最近の結果を含む。１ ８ ６，１ ８ ７は、Ｃ．Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ；Ｃ．Ｅｉｃｋｅｎ；Ｂ．Ｋｒｅｂｓ，Ａｃｃから再現された。 ケム Res.2002,35,183-191,American Chemical Societyからの許可を得て.
カテコラーゼ活性のメカニズム（外側の円）は、oxy状態とmet状態から始まります。 ジフェノール基質はmet状態に結合し（例えば）、続いて基質が第一のキノンに酸化され、酵素の還元状態が形成される。 二酸素の結合はオキシ状態につながり、続いて第二のジフェノール分子によって攻撃される。 第二のキノンへの酸化は再びｍｅｔ状態を形成し，触媒サイクルを閉じる。
代替反応機構には、北島とMorooka189によって提案されたラジカル機構と、モデル化合物の測定に基づくCu(III)中間体を含む機構が含まれる。190カテコールオキシダーゼ–PTU阻害剤複合体の結晶構造に基づいて、カテコールオキシダーゼに対する基質の単座結合が示唆された。180ラジカル機構は、タコ尋常性ヘモシアニンに見られる弱いカテコール酵素活性について提案されているように、191は、上記のようにI.batatas由来のカテコールオキシダーゼとodgヘモシアニンとの間の強い構造関係のためにカテコールオキシダーゼについても可能である。
カテコールオキシダーゼとチロシナーゼの明確な違いはまだ説明されていない。 チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性の遅れ期が発見され、研究されており、モノフェノール基質の過剰によるチロシナーゼのmet状態の一時的な阻害の結果であると提案されている（図25）。186モノフェノラーゼ活性は、ジフェノール生成物がmetチロシナーゼからモノフェノールを置換し、触媒サイクルの継続を可能にするときに増加する。 その単離された形態のカテコールオキシダーゼは、met状態で排他的に存在し、フェノールによっても阻害される。 したがって，カテコールオキシダーゼがクレソラーゼ活性を欠いているのは，オキシ状態の欠如が原因であることが示唆された。 オキシカテコールオキシダーゼもモノオキシゲナーゼ活性を示さないため、この説明は完全に満足できるものではないようである。 もう一つの考えられる理由は、モノフェノールの酸素化に必要であると提案されているCuAへのアクセスが、I.batatasのカテコールオキシダーゼの結晶構造でブロックされていることである192。