季節性インフルエンザAおよびパンデミックH1N1患者における二次細菌感染

要約

本研究の目的は、季節性インフルエンザaおよびインフルエンザa（h1N1）pdm09患者の大規模なグループにおける二次細菌感染を分析することである。 季節性インフルエンザAおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09と診断された患者は、2005年から2009年の間に研究に登録された。 データは、医療記録および実験室情報システム（LIS）から取得された。 合計で、実験室で確認されたインフルエンザを有する1094人の患者が研究された。 季節性インフルエンザAの352人の患者およびインフルエンザa（H1N1）pdm09の742人の患者がありました。 インフルエンザaの患者はより古く、インフルエンザa（H1N1）pdm09（および、respの患者より高いcomorbidityがありました。). 入院率はインフルエンザＡ群で高かった（）。 対照的に、ICU入院は、インフルエンザa患者（）よりもインフルエンザa（H1N1）pdm09患者で高かった。 インフルエンザa患者（H1N1）pdm09（および、resp）患者よりもインフルエンザa患者で採取された細菌サンプルおよび培養陽性の数が高かった。). 両方のグループで、陽性の細菌培養を有する患者の大部分は、基礎疾患を有していた。 本研究では、患者の特性と二次細菌感染の頻度は、季節性インフルエンザA患者とインフルエンザa（H1N1）pdm09患者で異なっていたことを示して

1. はじめに

ヒトインフルエンザウイルスとヒトおよび動物のインフルエンザウイルスの異なるサブタイプとの相互作用は、パンデミックの可能性を持つウイルスの新しい変異体を引き起こすことが示されている。 1918年、1957年、1968年の三つの以前のパンデミックはすべて、二次的な細菌感染のために部分的に過剰死亡率に貢献した。 1918年のパンデミックの場合、死亡率は2.5％と高いと報告された。 二次細菌感染がこれらの過剰死亡率の根底にある理由であることが示唆された。 1968年のパンデミック後、インフルエンザウイルスの季節的流行は抗原ドリフトによって生成されたA/H3N2ウイルス変異体によって支配され、この時に新たなパンデミックは発生しなかった。 しかし、2009年にはメキシコとカリフォルニアで新型インフルエンザA/H1N1ウイルスが出現し、21世紀初のインフルエンザパンデミックを発生させた。

これまでのインフルエンザ-パンデミックでは、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌による二次細菌感染が罹患率と死亡率の重要な原因となっていた。 したがって，二次細菌感染の疫学に関する情報は，正確な経験的抗菌療法の早期実施により，インフルエンザによる死亡率および罹患率の低下に重要な役割を果たす可能性がある。

以前の研究では、インフルエンザA(H1N1)pdm09は以前のインフルエンザのパンデミックとは異なることが示唆されており、二次細菌感染は現在のパンデミック中のインフルエンザ死亡において限られた役割を果たしているようである。 しかし、我々の知る限りでは、季節性インフルエンザAおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09による二次細菌感染に関する以前の比較研究はない。 これらのタイプの比較研究は、それぞれのインフルエンザタイプの二次細菌感染の特徴を理解するのに役立つかもしれない。

本研究の目的は、季節性インフルエンザAおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09患者の大規模なグループにおける二次細菌感染を分析することです。

2. メソッド

2.1. 研究材料とデザイン

季節性インフルエンザA（2005年から2008年の間）またはインフルエンザa（H1N1）pdm09（2009年）のいずれかの患者における二次細菌感染の存在を分析するレトロスペクティブ研究が設計された。 季節性インフルエンザAおよびインフルエンザA（H1N1）pdm09と診断されたすべての患者は、2005年から2009年の間に研究に登録された。 2005年から2008年の間のインフルエンザ患者は”インフルエンザA”としてグループ化された。 H1N1およびH3N2を含む複数の異なったインフルエンザウイルスが2005年と2008年の間の異なった期間の間に支配したので”インフルエンザA”のグループの患者が同質ではなかったことに注意することは重要である。 これらの患者をインフルエンザウイルスの種類に応じてサブグループ化することはできなかった。 両群で陽性の細菌学的所見を有する患者をさらに研究した。 レビュアーは標準化された形式を使用しました。 すべてのデータは、年齢、性別、併存疾患の存在、および剖検報告、入院期間（集中治療室滞在を含む）、および抗生物質/抗ウイルス治療の使用を含む臨床プレゼンテー 陽性の細菌学的所見は、血液培養中の任意の成長または気道サンプル中の関連する病原性気道細菌の成長として定義された。 微生物学の結果は、医療記録および実験室情報システム（LIS）から収集された。

2.2. ウイルス

群がった綿棒または鼻咽頭吸引液の検出は、後鼻咽頭から呼吸器上皮細胞を収集するために使用されていました。

季節性インフルエンザAの検査室での診断は、免疫蛍光（IF）によるインフルエンザa抗原の検出によって行われました。 試料を１ ０ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間遠心分離して、直接免疫蛍光（ＤＦＡ）のために細胞をペレット化した。 次いで、細胞ペレットを少量のリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、１ ０ ０μ ｌを、細胞遠心分離（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｐｉｎ２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ Ａ，ＵＳＡ）により、１ ２ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間、ガラススライドに適用した。 スライドを空気乾燥し、次いで冷たいアセトン中で１ ０分間固定した。 細胞スポットを、Ｐａｔｈｏｄｘ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｐａｎｅｌ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）からの市販のｄｆａキットからの共役モノクローナル抗体２ ５μ ｌで３ ７℃で１ ５分間染色した。 リン酸緩衝生理食塩水で繰り返し洗浄した後、スライドを70％グリセロールに取り付け、顕微鏡下で調べた。 蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて特異的な蛍光を示す少なくとも１つの無傷の細胞の存在によって陽性の結果が示された。 試験片がDFA試験に適していると考えられるためには、ガラススライドあたり50以上の上皮細胞の存在が必要であった。 Ｐａｔｈｏｄｘからの陽性および陰性対照ならびに培養インフルエンザａ株からの対照を用いた。

パンデミックインフルエンザH1N1の診断には、インフルエンザA(H1N1)pdm09のサブタイプ特異的プライマーを用いたリアルタイム逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(rRT-PCR)を用いた。 Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｍ４ ８キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｍｂｈ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｑｉａｇｅｎ Ｍ４ ８Ｂｉｏｒｏｂｏｔと共に製造業者の説明書に従って、４ ０ ０μ ｌのサンプル容積を抽出した。 ＲＮＡを１ ０ ０μ Ｌの最終体積まで溶出した。 水を陰性対照として使用し、インフルエンザウイルス単離物であるＡ／Ｓｈｏｃｈｏｌｍ２／２ ０ ０ ９Ｈ１Ｎ１を各抽出の陽性対照として使用した。 使用されたＰＣＲ法は、ｓｗｅｄｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌによって提供されたワンステップＲＲＴ−ＰＣＲであった。 使用したプライマーは、ヘマグルチニン遺伝子を増幅する５’ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴ Ｇ Ａ Ａ ＴＴＴ ＴＡＣ ＣＡＣ Ａ Ａ３’および５’ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＡＧ ＴＣＡ Ｔ Ａ Ａ ＧＴＣ ＣＣＡ ＴＴＴ Ｔ３’であった。 使用したプローブは、５’−ＦＡＭ−ＴＧＣ ＧＡＴ ＡＡＣ Ａ ＣＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’であった。 ＰＣＲには、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用した。 使用したＰＣＲプログラムは、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４ ８ ０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５ ０℃で１ ５分間逆転写、続いて９ ５℃で２分間、９ ５℃で５秒間、６ ０℃で６ ０秒間、および４ ０℃で３ ０秒間の４ ５サイク 結果が陽性とみなされるためには、シグモイド蛍光曲線とともに≥40のしきい値サイクル（）が必要であった。

2.3. 細菌の検出

季節性インフルエンザAまたはインフルエンザA（H1N1）pdm09陽性のすべての患者は、カロリンスカ大学病院、Huddingeの臨床微生物学ラボラトリーデータベースで、気道または血液からの陽性細菌培養の存在について交差検査された。 血液試料を、Ｂａｃｔ／ＡＬＥＲＴ３Ｄ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｉｎｃ． Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）自動血液培養システム。 臨床試料からの細菌の検出は、標準的な方法によって行われた。

3. 統計分析

Fisher exact検定とStudents t検定は、カテゴリ比較と2つのグループの比較にそれぞれ使用されました。 の値は統計的に有意であると考えた。

3.1. 倫理的許可

この研究は、スウェーデンのストックホルムの地域倫理審査委員会（Dnr2010/266-31）によって承認されました。

4. 結果

4.1. 細菌所見

合計で、実験室で確認されたインフルエンザ患者1094人が研究された。 研究グループでは、季節性インフルエンザA患者352人、インフルエンザa（H1N1）pdm09患者742人がいた。 細菌学的サンプリングの数は、インフルエンザA（H1N1）pdm09、240/352（68.18％）対99/742（13.34％）、それぞれ（）の患者よりも季節性インフルエンザa患者で高かった。

陽性細菌培養は、インフルエンザA（H1N1）pdm09およびインフルエンザa患者の総数に関連してさらに分析された。 インフルエンザa患者のうち、33/352（9.38％）は陽性の細菌学的サンプルを有していた。 上気道、下気道、および血液から陽性の培養を有するインフルエンザa陽性患者の数は、以下のとおりであった。20/352 (5.68%), 13/352 (3.69%), および8/352(2.27%)、それぞれ(表1)。

インフルエンザA（H1N1）pdm09陽性患者の38/742（5.12％）では、培養物は細菌の増殖に陽性であった。 上気道、下気道、および血液からの陽性培養を有するインフルエンザA（H1N1）pdm09陽性患者の数は、以下のとおりであった15/742 (2.02%), 12/742 (1.62%), 12/742(1.62%) 培養物中で同定された異なる細菌種を表１に示す。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の症例はなかった。

合計で、インフルエンザA患者は、インフルエンザa（H1N1）pdm09（）患者よりも陽性培養の数が高かった。 陽性の上部および下部気道培養の数は、インフルエンザa患者（H1N1）pdm09（および、resp。). 両群の間で陽性血液培養の数に差は認められなかった（表1）。

4.2. 患者の特徴

二次的な細菌感染の発生の可能性のある根底にあるメカニズムを理解するために、気道および血液中の関連する細菌学的所見が正 これらの患者の医療記録が見直され、ベースライン特性が表2に示されている。 これらの患者のために、細菌所見の臨床的意義は、微生物学研究所からの結果に対する臨床医の応答の評価によって決定された。

季節性インフルエンザA患者とインフルエンザA（H1N1）pdm09患者の間のベースライン特性に差があった。 季節性インフルエンザa群の患者の年齢中央値は、インフルエンザA（H1N1）pdm09群よりも有意に高く、それぞれ57.5歳対30.5歳であった（）。 女性は両方の患者群で過半数であり、季節性インフルエンザA患者では57.58％、インフルエンザa（H1N1）pdm09患者では65.79％であった。

併存疾患を有する患者の総数は、季節性インフルエンザA群で有意に高かった（）。 グループの研究前罹患率を比較すると、季節性インフルエンザA患者は、インフルエンザA（H1N1）pdm09患者7/33（21.21％）対1/38（2.63％）よりも有意に多くの心血管疾患を有していた（）。 33(6%)季節性インフルエンザa患者のうち、インフルエンザA(H1N1)pdm09患者の中でどれもに比べて真性糖尿病を持っていた。 免疫抑制につながる条件は、二つのグループで同様に一般的であり、リンパ増殖性疾患、急性骨髄性白血病（AML）または慢性リンパ球性白血病（CLL）、幹細胞移植、およ 慢性肺疾患および慢性腎疾患の存在は両群で類似していた。

症状の発症から医療を求めるまでの時間の中央値は、両方の研究グループで同様であった。 対照的に，入院期間と集中治療室（ＩＣＵ）入院期間にはかなりの差があった。 インフルエンザa患者は、インフルエンザA（H1N1）pdm09患者30/33（90.90％）対24/38（63.16％）よりも病院に入院することが多かった（）。 インフルエンザA患者の入院率が高いにもかかわらず、この差は統計的に有意ではなかったが、インフルエンザa（H1N1）pdm09患者に比べて季節性インフ 興味深いことに、ICUアドミタンスは、インフルエンザA（H1N1）pdm09患者と比較して季節性インフルエンザa患者では、それぞれ2/33（6.06％）対11/38（28.95％）で低かった（）。

4.3. 抗菌治療

抗ウイルス治療（オセルタミビルまたはザナミビル）は、季節性インフルエンザA患者の10/33（30.30％）およびインフルエンザa（H1N1）pdm09患者の18/38（47.37％）に使用された。 治療時間は、すべての季節性インフルエンザA患者とインフルエンザA（H1N1）pdm09患者のほとんどのための5日でした。 延長抗ウイルス治療は、長いICU滞在（>7日）を持っていたインフルエンザA（H1N1）pdm09と6人の患者に与えられました。 これらの患者における抗ウイルス治療の長さは、6と35日（平均=22日）の間であった。 これらの患者はすべて、既存の血液学的疾患（骨髄腫、CLL、またはAML）または重度の慢性肺疾患に罹患していた。 これらの患者のいくつかは、抗ウイルス治療にもかかわらず、ICU滞在中、インフルエンザA（H1N1）pdm09のPCR陽性のままであった。

季節性インフルエンザA患者とインフルエンザa（H1N1）pdm09患者の抗菌治療を受けた患者の数は、それぞれ26/33（78.79％）と25/38（65.79％）であった（表2）。 季節性インフルエンザａ流行で選択された抗菌体制はより大きな異質性があった。 経口（Ｐ ｏ）療法としてはペニシリンとアモキシシリンが最も一般的であり，続いてドキシサイクリンが密接に使用された。 より重篤な症例では，静脈内（Ｉ ｖ）投与が好ましい場合には，セフロキシム単独またはアミノグリコシドと組み合わせたペニシリンＧを経験的治療として選択した。 ＩＶ療法からＰＯ療法への切り替え時にはアモキシシリンまたはドキシサイクリンを用いた。 他の経験的な抗生物質の選択肢は、アミノグリコシドと組み合わせたカルバペネム、キノロン、およびマクロライドであった。 抗生物質の処置は7-10日間普通持続しました。 ICUで長期間（>7日間）治療された患者は、より広いスペクトルのIV抗菌療法を受けた。 これは、大部分の症例において、人工呼吸器関連気道感染症または他のＩＣＵ関連感染症に関連していた（データは示されていない）。

インフルエンザA(H1N1)pdm09患者をPO抗生物質で治療した場合、経験的治療としてアモキシシリンまたはアモキシシリン-クラブラン酸が好まれた。 IV療法を選択したとき、ペニシリンGまたは第二/第三世代のセファロスポリンが最も一般的に使用された。 ICUに入院した患者は、常に第二/第三世代のセファロスポリンを受けた。 重度の炎症反応および/または重度の呼吸不全を有する症例では、経験的治療としてキノロン（モキシフロキサシン）を添加した。 敗血症性ショック／ＡＲＤＳの症例では，セファロスポリン療法はしばしばアミノグリコシドと併用された。 ピペラシリン/タゾバクタムおよびカルバペネムは、ICUで長期間（>7日間）治療されない限り、ICU患者ではめったに使用されなかった（データは示されていない）。

5. ディスカッション

二次的な細菌感染は、以前のインフルエンザのパンデミック中の罹患率と死亡率の重要な貢献者であった。 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびｓ．ａｕｒｅｕｓがこれらの患者群における過剰死亡率に寄与していることが示されている。 同じ設定の異なったタイプのインフルエンザウイルスとの二次細菌感染の特徴そして発生を比較する前の調査がありません。

ここでは、2005年から2009年の間にカロリンスカ大学病院で診断された季節性インフルエンザAおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09インフルエンザ患者の大規模なグループにおける二次細菌感染を分析した。

一年のインフルエンザA（H1N1）pdm09陽性患者の数は、4年の季節性インフルエンザA患者の数、それぞれ742人対352人よりも有意に高かった。 2009年の間に、インフルエンザa（H1N1）pdm09を識別するための診断テストは広く使用されました。 臨床医は、スウェーデン国立保健福祉委員会によって、インフルエンザA（H1N1）pdm09インフルエンザの疑いのあるすべての症例を検査し、パンデミックの拡大を追跡し、抗ウイルス治療を受けるべきリスクグループの患者を特定するように指示された。 研究におけるインフルエンザA（H1N1）pdm09陽性患者の高い数は、おそらくこのウイルスのサンプリングの高い数に依存する可能性があります。 この研究では、季節性インフルエンザAおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09に使用される診断方法も異なっていた。 インフルエンザA（H1N1）pdm09に使用されるPCR法は、2005年から2008年の間に季節性インフルエンザAに使用されたIFよりも敏感であることが以前に示さ 二つの方法の性能の違いはまた、インフルエンザA（H1N1）pdm09陽性の高い数の役割を果たしている可能性があります。 別の可能性は、インフルエンザA（H1N1）pdm09ウイルスは、季節性インフルエンザaウイルスよりも患者の高い数に感染していることです。

以前の研究では、インフルエンザA(H1N1)pdm09インフルエンザは主に若い患者に感染することが示されています。 現在のデータは、重度のインフルエンザを発症する若いインフルエンザA（H1N1）pdm09感染患者は、多くの場合、既存の複雑な疾患に苦しむことを示唆 入院率はインフルエンザＡ群で高かった（）。 対照的に、ICU入院は、インフルエンザa患者（）よりもインフルエンザa（H1N1）pdm09患者で高かった。 インフルエンザA（H1N1）pdm09患者は、より若く、より健康であるグループとして、おそらく緊急治療室から排出される可能性が高かったが、入院した個人は、特に免疫抑制に苦しんでいる個人のサブグループにおいて、感染のより深刻な経過を有することが多かった。

インフルエンザA患者では、インフルエンザa患者(H1N1)pdm09(and,resp.). しかし，季節性インフルエンザＡ患者では細菌培養がより大きな割合で行われたため，研究における二つの患者群はサイズが異なり，部分的に選択が異なっていた。 両方のグループで、陽性の細菌培養を有する患者の大多数は、基礎疾患を有していた。 血液培養では，ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとｃｏａｇｕｌａｓｅ陰性ブドウ球菌が両群で最も一般的な分離株であった。 インフルエンザＡ患者の下気道試料から単離された三つの最も一般的な細菌種は，ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅであった。 インフルエンザA（H1N1）pdm09患者では、下気道培養ではなく、黄色ブドウ球菌、streptococcus dysgalactiae、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって支配された。 この違いの理由は知られていません。

研究された材料では、下気道または血液中の黄色ブドウ球菌および肺炎球菌の増殖が抗生物質治療につながることが示された。 コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を有する陽性血液培養の大部分は汚染と解釈され、その後抗生物質治療を受けなかった。 上気道培養陽性の患者は，下気道培養および血液培養陽性の患者よりも少ない程度で抗生物質治療を受けた。 これは、他の人が以前に示したように、急性ウイルス性呼吸器疾患の間の病原体を含む多くの細菌の上気道の植民地化の増加によって部分的に説明

本研究では、季節性インフルエンザA患者の30.30％およびインフルエンザa（H1N1）pdm09患者の47.37％が抗ウイルス治療を受けた。 パンデミックの間に、スウェーデンの国民健康福祉委員会はインフルエンザの徴候の始めの後の2-3日以内の抗ウイルス性の処置を始めるように インフルエンザ患者は、病気の最初の4日以内に開始されれば、抗ウイルス治療から利益を得ることが示されている。 インフルエンザA（H1N1）pdm09を持ついくつかの患者は、インフルエンザの症状の4日後に医療の助けを求め、したがって、抗ウイルス治療のために不

現在および以前の研究では二次的な細菌感染の頻度が低いにもかかわらず、季節性インフルエンザAまたはインフルエンザA（H1N1）pdm09の患者の大部分は抗菌治療を受けた。 これらの感染症における細菌病因に関する我々の結果は、インフルエンザaおよびインフルエンザa（H1N1）pdm09患者における経験的抗生物質療法は、主にs.pneumoniaeおよびs.aureusに対して指示されるべきであることを示唆している。 スウェーデンの設定では、一般的に、MRSAの経験的なカバレッジの必要はありません。

振り返ってみると、スウェーデンにおけるインフルエンザA（H1N1）pdm09の経過は、最初に疑われたほど深刻ではなかった。 ここに示されるように、多数の二次細菌感染の欠如は、特に1918年のパンデミックと比較されるとき、病気の良性経過の根本的な理由の1つであるかもし 但し、少数の個人のために、インフルエンザa（H1N1）pdm09の伝染に二次細菌感染と同様、ウイルス性肺炎による厳しいコースがありました。 したがって、インフルエンザと二次細菌感染の両方の早期正確な診断は、これらの患者の死亡率と罹患率を減少させる上で重要である可能性があ

著者の貢献

Karin LiderotとMarcus Ahlは、この研究にも同様に貢献しています。

謝辞

この研究はカロリンスカ研究所からの助成金によって支持された。 この論文に関連する利益相反は著者らによって報告されなかった。