微生物学のFrontiers

Introduction

アストロウイルス科には、哺乳動物と鳥類に感染するママストロウイルスとアバストロウイルスの二つの属に非エンベロープ、陽性センス、一本鎖RNAウイルスが含まれている。 現在、ウイルスの分類に関する国際委員会（International Committee on Taxonomy of Viruses,2018）は、ママストロウイルス属内の19種、すなわちママストロウイルス-1から-19を認識していますが、分類を待っている多くの株があり、そのうちのいくつかは暫定的に新種と考えられています（Donato and Vijaykrishna,2017）。

2010年以降、いくつかのアストロウイルスは、ヒトを含む様々な哺乳動物種において神経侵襲性としてますます認識されている(Quan et al. ら、２ ０ １ ０；Ｎａｃｃａｃｈｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、2015）、ミンク（Blomströmら、2015）、ミンク（Blomström et al. ら、２ ０ １ ０）、ウシ（Ｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３）、羊（Ｐｆａｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ７）、およびブタ（Ｂｏｒｏｓら、２ ０ １ ８）、およびブタ（２ ０ １ ９）。, 2017). 米国牛におけるウシアストロウイルス関連脳炎の最初の認識後（Li et al. ら、2013）、スイスからの病因不明の散発性ウシ脳炎の症例における遡及的研究は、この神経侵襲性アストロウイルスが何十年も検出されなかったことを明, 2016). これらのアストロウイルスの疫学および伝達経路は不明であるが、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで牛および卵の神経侵襲的なアストロウイルスの間で共有される高いレベルの同一性（>98％）に基づいて、種間伝達が示唆されている（Boujon et al., 2017).

ウシのアストロウイルス（Boastv）、BoAstV-Neurose1と命名された（Li et al. ら、２ ０ １ ３）およびＢｏａｓｔｖ−Ｃ Ｈ１ ３（Ｂｏｕｚａｌａｓら、２ ０ １ ３）。,2014),最初に非化膿性脳炎の牛の脳で発見されました。,米国とスイスで,それぞれ. 異なる命名法にもかかわらず、両方のウイルスは同じ遺伝子型種を表す（Ｂｏｕｚａｌａｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ６；Ｓｅｌｉｍｏｖｉｃ−Ｈａｍｚａ ｅ ｔ ａ ｌ． 2017a）は、ICTVによる公式の分類をまだ待っている。 2015年には、スイスの脳炎の牛の脳にBoAstV-CH15という未知のBoAstV株が同定された。 完全なゲノム系統発生比較は、boastv-CH13よりもovineアストロウイルス（OvAstV）とBoAstV-CH15の密接な関係を明らかにした（Seuberlich et al., 2016). Ｂｏａｓｔｖ−Ｃ Ｈ１ ３およびＢｏａｓｔｖ−Ｃ Ｈ１ ５との共感染もまた、１つの症例において文書化された（Ｓｅｕｂｅｒｌｉｃｈ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). 同じ年にドイツで、Schlottau et al. (2016)は、脳炎を有する牛において、OvAstVおよびBoAstV-CH15と最も密接に関連していた新規なアストロウイルス、すなわちBoAstV-BH89/14を報告した。 その後、BoAstV-CH13/Neurose1は、カナダ東部および西部のウシ脳炎の症例において2017年に同定された（Spinato et al. ら、２ ０ １ ７；Ｓｅｌｉｍｏｖｉｃ−Ｈａｍｚａ ｅ ｔ ａ ｌ．、2017b）。 2018年には、日本における非化膿性脳脊髄炎を伴うステアにおいて、北米および欧州のBoAstV-Neuros1/BoAstV-CH13と密接に関連する新規な神経侵襲性BoAstVが同定され、北米と欧州の株間の遺伝子型内組換えの発生が示唆された（Hirashima et al., 2018).

アストロウイルス関連脳炎の症例は北米、欧州、アジアで報告されているが、その存在は南半球では記録されていない。 ここでは、地理的分布と神経浸潤性アストロウイルスの遺伝的多様性を広げ、このウイルスがヨーロッパからアメリカに導入され、後にアジアに広

材料と方法

歴史とシグナル

2018年6月、ウルグアイのコロニアにある∼300ヘクタールの農場で37頭のグループの22ヶ月のホルスタインの雄牛が、異常な行動、目的のない歩行、旋回、運動失調、反復的で協調していない舌の動き、および臥床を含む進行性の神経学的歌を発症した。 群れは毎年恒例のオート麦の牧草地で放牧され、トウモロコシのサイレージが補充されました。 獣医開業医による脳リステリア症の推定臨床診断は、ペニシリンとストレプトマイシンによる治療を促したが、動物は3日間続く臨床経過後に自発的に死亡した。

病理学的検査、in situハイブリダイゼーション（ISH）および免疫組織化学（IHC）

雄牛の頭を枝肉から取り出し、診断作業のためにINIAの獣医診断研究所（Animal Health Platform）に提出した。 脳の半分、近位頚髄（C1）、三叉神経節および三叉神経の根、唾液腺、後咽頭リンパ節、中咽頭、食道、舌および骨格筋の短いセグメントは、10％中性緩衝ホルマリンに48-72グラムの汚れ。５Ｒｅｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｔ＃３ ２ ２ ３ ６ ０，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）およびＢｏａｓｔｖプローブＣａｔを使用して、ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ ｓｌｉｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）上のホルマリン固定、パラフィン埋め込み（ＦＦＰＥ）脳幹、大脳および小脳の５μ ｍ切片に #406921. プローブは、ウイルスの領域5232-6180を標的とする20ZZペア（GenBank KF233994.1）で構成されている。 組織の各5μ mセクションは、プローブハイブリダイゼーションの前に熱およびプロテアーゼで前処理され、2時間40℃で製造業者の推奨に従って処理された。 信号の検証に使用される負のコントロールは、シリアルセクションと感染していない動物からの組織をプロービング上で実行される無関係な（GCコンテン スライドをヘマトキシリンで対比染色し、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）で装着した。

さらに、ウェストナイルウイルス（WNV、フラビウイルス）の同定のために、脳幹、大脳および小脳のFFPE切片においてIHCを行った（Palmieri et al. ら、２ ０ １ １）、狂犬病ウイルス（リサウイルス）（Ｓｔｅｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ０）、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ． （Ｇｉａｎｎｉｔｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ．、2016年）。＜７ ７ ５ ５＞＜７ １ ３ ３＞Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＜９ ４ １ ２＞＜１ ５ ９ ９＞Ｍａｇｍａｘ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、凍結（−２ ０℃）脳のプールされたサンプルから核酸抽出を達成した。 アストロウイルス検出のために、逆転写（Ｒ Ｔ）を、Ｒｅｖｅｒｔａｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｒａｎｄｏｍ ｈ ｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。 ＰＣＲは、ｍａｎｇｏｍｉｘ（登録商標）（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびアストロウイルスポリメラーゼ遺伝子の４ ３ ２ヌクレオチド断片を増幅するプライマー（Ｔｓｅ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ ０ ２）を使用してｃＤＮＡから実施した。, 2011). ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で可視化し、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｏ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃで配列決定した。 （ソウル、韓国）。 アストロウイルス全ゲノム増幅のためには、ｃＤＮＡの観察のためのＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｏｌｉｇｏ（Ｄ Ｔ）１ ８、ならびにＨｉｒａｓｈｉｍａらによって記載されるプライマーを用いたＭａｎｇｏｍｉｘ（登録商標）（Ｂｉｏｌｉｎｅ）またはＲａｎｇｅｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）が挙げられる。、2018年、使用された。 PCR産物を1-2％アガロースゲル中で可視化し、精製し、上記のように配列決定した。 配列の組み立ては、Ｓｅｑｍａｎ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ８，ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて行った。 牛、羊、豚、ヒトおよびミンクからの神経侵襲性アストロウイルスの二十から六の完全なゲノム配列、およびGenBankで利用可能な腸性ウシアストロウイルス, 2016). Ｗ−ＩＱ−ＴＲＥＥ１（Ｔｒｉｆｉｎｏｐｏｕｌｏｓら（１ ９ ９ ９））。,2016)を用いて、配列進化の最良適合モデル(SYM+I+G4)を決定し、この場合に検出されたBoAstVのほぼ完全な配列とGenBankからダウンロードされた完全な配列との最尤系統樹を構築するために、bootstrapを用いてクレードのロバスト性を評価する統計的方法として使用した。 類似性プロットは、Ｓｉｍｐｌｏｔソフトウェア（Ｌｏｌｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). ＯＲＦ２のアミノ酸レベルでのｐ−距離は、ＭＥＧＡ７ソフトウェアを用いて推定した（Ｋｕｍａｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016).

さらに、BEAST v1.8.4パッケージを用いてベイズ系統地理学的解析を行った(Drummond et al.、2012年）を使用して、: BoAstV CH13/Neuros1系統の完全なコード領域、Orf1Ab（非構造遺伝子）、ORF2（構造遺伝子）、Orf1A（プロテアーゼ）および部分的なOrf1B（ポリメラーゼゲノム領域、カナダ株が利用可能であった）、GenBank（最後のアクセッションApril18、2019）で利用可能なすべての配列を用いて、進化速度、共通の祖先の年齢/年、および国（スイス、ウルグアイ、米国、カナダ、および日本）によるウイルス循環の最も可能性の高いルートを決定する。 データセット内の再結合の欠如は、再結合検出プログラム4を用いて決定された。 各アライメントに最もよく適合する置換モデルは、ベイズ情報基準（BIC）値を介してMEGA7ソフトウェアを使用して決定され、各データセットの時間構造はTempEst（Rambaut et al., 2016). Ｂａｙｅｓスカイライン解析を用いた対数正規緩和分子時計を，使用した分子時計と合体樹プリオの異なる組み合わせの中からＢａｙｅｓ因子によって選択した。 検出の国は形質として使用されました。 マルコフ連鎖モンテカルロの長さは100万世代であり、Tracer v1.6で評価された解析の収束を保証した。0、および事後確率を使用してクレードを評価しました。 最大クレード信頼性ツリー（MCCT）は、BEASTからTreeAnnotatorソフトウェアを使用して得られ、FigTree v1.4.3で視覚化されました。

最後に、前述のように、凍結脳から抽出されたDNAを、ウシヘルペスウイルス1および5（BHV-1および-5）の検出のためにPCRによって処理した（Ashbaugh et al., 1997).

細菌学

大脳および脳幹の新鮮なサンプルは、血液およびMacConkey寒天中の好気性細菌培養およびListeria monocytogenesの選択培養のために日常的に処理された（Al-Zoreky and Sandine、1990）。

結果と考察

本明細書に記載されている症例の臨床徴候および疫学的所見は、非特異的ではあるが、通常散発的であると記載されているウシアストロウィルス関連脳炎の他の症例に記載されているものと同様であった(Selimovic-Hamza et al. ら、２ ０ １ ６）、種々の神経学的欠損を伴う（Ｄｅｉｓｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ７）、典型的には１日〜３週間の範囲の臨床徴候の持続時間を有する（Ｓｃｈｌｏｔｔａｕ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ １ ８）。 ら、２ ０ １ ６；Ｄｅｉｓｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ７；Ｓｐｉｎａｔｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ７；Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2018).

脳、脊髄のC1セグメント、および頭部の他の組織の肉眼的検査では、有意な肉眼的な解剖学的病変は明らかにされなかった。 組織学的には，終脳（大脳半球および海馬を含む），脳幹および脊髄の唯一の検査セグメントに影響を及ぼす中等度から重度のリンパ球性，組織球性および形質細胞性髄膜脳脊髄炎があった。 病変は主に灰白質および白質の限界領域に分布していた。 患部では血管周囲カフおよびリンパ球および組織球性炎症および隣接する神経障害にグリオーシスを伴う神経壊死/神経食が認められた。 影響を受けた壊死性ニューロンの衛星化があった（図1A–D）。 多巣性中等度小脳性レプトメニング炎が認められたが，小脳実質では病変の頻度ははるかに少なく，重症であった。 病巣内細菌はH&Eとグラム染色で発見されませんでした。 他の検査組織では有意な組織学的変化は認められなかった。

中枢神経系の組織学的検査で神経浸潤性ウイルス感染が疑われた。 多くの反芻動物の神経病原体が人獣共通感染症であるため、脳炎を有する牛が懸念されている（Cantile and Youssef、2016）; したがって、脳炎の診断は、可能な場合には感染性病原体をスクリーニングするために広範な実験室試験を促すべきである。 本明細書に記載の場合、WNV、狂犬病ウイルスおよびクラミジア属に対するIHCs。、およびBHV-1および-5のPCRはすべて陰性であり、病原菌は脳組織から培養されなかった。 雄牛は<2歳であり、脳幹に海綿状の変化は観察されなかったため、ウルグアイでは報告されていない成牛のエキゾチックな病気であるウシ海綿状脳症（BSE）の試験は行われなかった。 さらに、BSEは炎症性ではない（Cantile and Youssef、2016）。

BoAstV-Neurose1から生成されたプローブを用いてIn situハイブリダイゼーションを行い、大脳半球および海馬のニューロンの細胞質内に豊富で限定されたプローブハイブリダイゼーションがあった（図1E–G）。 これらの領域では、プローブハイブリダイゼーションは、グリア細胞、または血管周囲袖口の炎症細胞で検出可能なないプローブハイブリダイゼーションと、壊死性ニューロンとグリア症の領域と共局在した。 Ｉｓｈによるウイルス核酸は小脳には検出されず，実質には炎症性病変は最小限であったが中等度のレプトメニング炎，または重度の炎症を伴う切片を含む脳幹であった。 これは、地形的に、ＩＳＨによるウイルス分布の検出が、ウシにおけるＢｏａｓｔｖ−Ｃ Ｈ１ ３／Ｎｅｕｒｏｓ１関連脳炎の症例で時折記載されている、検査されたセクションにおける脳炎よ,2017a,b). 脳の病変領域におけるウイルスRNA検出のこの時折の欠如の理由は、以前に示唆されたように、ISHの検出限界、または死亡時までの脳の炎症領域におけるウ、2017b）。 予想されるように、陰性対照として使用された脳組織において、ｉｓｈによってプローブハイブリダイゼーションは検出されなかった。

アストロウイルスはRT-PCRにより脳内に検出された。 ほぼ完全なゲノム配列解析は、CH13/Neuros1クレード内のママストロウイルス株を明らかにし、我々はBoAstV-Neuro-Uyと命名し、配列はaccession番号MK386569の下でGenBankに寄託された。 系統解析では、最も知られている神経侵襲性アストロウイルスを含むバージニア/ヒトミンクオビン（VA/HMO）クレード内の他の神経侵襲性アストロウイルスとの近 ら，２ ０ １ ８；Ｒｅｕｔｅｒら，２ ０ １ ９．, 2018). BoAstV-Neuro-Uyのほぼ完全な配列は、長さが6427bpであり、Kagoshimasr28-462株と94％の配列同一性を有する。 BoAstV-Neuro-Uyは系統CH13/Neuros1の他の株と同様の特徴を持っています：51ntの5’UTR領域、861アミノ酸（aa）のOrf1A（プロテアーゼ）、523aa（RNA依存性RNAポリメラーゼ）のOrf1B、および758aa（キャプシドタンパク質）のORF2。 残念なことに、３’ＵＴＲは配列決定できなかったが、オリゴ（ｄ Ｔ）１ ８をｃＤＮＡを得るために使用したので、ポリ（Ａ）尾部が存在すると推定される。 さらに、リボソームフレームシフトシグナルであるヘプタマー AAAAAAC配列が存在する。 ORF2のアミノ酸レベルでのP距離は、CH13/Neuros1クレードへのこの株の割り当てを確認した。 P-距離<0.Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ−１ ３は、他の著者によって最近提案されている（Ｄｏｎａｔｏ ａｎｄ Ｖｉｊａｙｋｒｉｓｈｎａ，２ ０ １ ７；Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ １ ７）。 2018年現在、ICTVによる明確な種の割り当ては保留されている。 BoAstV-Neuro-Uyから生成されたISHに使用されるプローブは、BoAstV-Neuro-Uyと92.7％の配列同一性を有していた。

神経病理学的検査およびアストロウイルス核酸およびタンパク質の検出に基づく研究は、アストロウイルス感染と牛の神経疾患および病変との間に因果関係があると結論づけている(Selimovic-Hamza et al. ら、２ ０ １ ７ａ；Ｒｅｕｔｅｒら、２ ０ １ ８ａ．, 2018). 我々の知る限りでは、アストロウイルス関連脳炎はまだ実験的に再現されていない。 これは臨床例からの神経浸潤性アストロウイルスの分離を必要とするが，これは我々の症例では試みられなかった。

この場合のBoAstV-Neuro-Uyの発生源は特定できませんでした。 しかし、牛は広範な屋外条件下で飼育されているため、貯水池の牛や野生動物を考慮する必要があります。 影響を受けた動物は、2018年2月に他の9頭とともに購入され、農場に移されました。 残念なことに、所有者は、プロパティ内の他の動物のさらなるサンプリングとテスト、およびより詳細な疫学的調査を拒否しました。 グループ内の他の動物のいずれも、獣医開業医が最後に接触した8月の2018の時点で神経学的疾患を発症していなかった。 スイスにおけるアストロウイルス関連脳炎の症例については、冬の初めから春の終わりまでの季節性が示唆されている（Selimovic-Hamza et al., 2016). 興味深いことに、ここに記載されているケースは、南半球の秋-冬の移行期に対応して、月に発生しました。

北米では神経栄養性アストロウイルスが同定されている（Li et al. ら，２ ０ １ ３；Ｓｐｉｎａｔｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ７）、欧州（Ｂｏｕｚａｌａｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４）およびアジア（Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅ ｔ ａ ｌ． 2018年）、彼らの存在は南半球では報告されていないので、この通信はアストロウイルス関連脳炎の地理的分布を広げる。 ウルグアイで検出されたウイルス株は、ヨーロッパ、北米、またはアジアに由来している可能性があるかどうかを評価するために、我々は進化速度を推定し、GenBankで利用可能な神経侵襲的BoAstVシーケンスを使用して系統地理学的解析を行った。 完全な符号化領域を用いて推定された進化速度は4であった。27×10-4(95%最高確率密度-HPD–,2.19-6.46×10-4)ヌクレオチド置換/部位/年であり、これはRNAウイルスについて予想される(Jenkins et al. ら、２ ０ ０ ２）、しかし、腸内ヒトアストロウイルスについて推定されたものよりも低い（Ｂａｂｋｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012, 2014). Orf1Ab領域は、完全なコード領域と同様の進化速度（4.20×10–4、95％HPD1.66-6.46×10-4置換/サイト/年）を示し、一方、Orf1A（2.92×10-4、95％HPD1.19×10-6-6.46×10-4置換/10-6-579×10-4置換/サイト/年）はわずかに速い進化速度を示し、部分ポリメラーゼゲノム領域（Orf1B）はわずかに遅い進化速度（5.39×10-4、95％HPD6.41×10-7-1.10×10-3置換/サイト/年）を示した。

完全なコード領域を持つ系統解析によって決定され、MCTTに示されているように（図3）、共通の祖先を持つ参照株に基づいて二つのサブ系統（CH13とNeurose1）があ これらの亜系統（系統CH13/Neurose1）の最も最近の共通の祖先は、およそ1885年（95％HPD、1794年-1940年）にヨーロッパで発生しました。 1900年代の初めに、二つのサブ系統が分岐し、CH13サブ系統はヨーロッパで循環し続け、Neurose1サブ系統はアメリカとアジアに広がった。 最も可能性の高いシナリオは、1921年頃（95％HPD、1849-1967）にヨーロッパからウルグアイに導入されたNeurose1サブ系統が、おそらく家畜貿易を通じて北米に、後に日本に広 GenBankで利用可能な配列数の制限のために、分析に偏っている可能性があり、完全なコード領域を使用して得られた結果は、より多くの株（すなわち、カナダ株） すべての分析において、最も可能性の高いシナリオは、ウルグアイへのウイルスの導入がヨーロッパから発生したことである（補足図S1A–D）。 さらに、Orf1Abおよび部分ポリメラーゼゲノム領域（Orf1B）で得られたこの導入の推定日（補足図S1A、D）は、完全なコード領域で得られたものと同様であったが、ORF2およびOrf1Aで得られた導入の推定日は以前であったが、より広い95％HPD間隔（補足図S1B、C）であった。 副系統Neurose1をヨーロッパからカナダに直接導入し、その後米国および日本に普及させたことも妥当であり、補足図S1Dに示されている。

地理的分布、病原性メカニズム（特に伝播と侵入のメカニズム）、分子疫学、および神経侵襲性アストロウイルスの種間伝達の可能性を評価するためには、さらなる調査が必要である。

データの可用性

この研究のために生成されたデータセットは、GenBank、MK386569にあります。

著者の貢献

FG、RDC、MCはこの研究の概念に貢献しました。 ＦｇとＲＤＣは病理学的検査とサンプリングを行った。 ＰＰはｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。 ＦＵは免疫組織化学を行った。 ＬＭ，ＲＣ，ＭＣは分子ウイルス学的試験を行った。 ＭＣは配列および系統地理学的解析および関連する図を行った。 ＦｇとＰＰは組織像を得た。 ＭＦは細菌培養を行った。 FGとMCは原稿の最初の草案を書いた。 RDC、PP、FU、LM、MF、RCは原稿のセクションを書いた。 すべての著者は原稿の改訂に貢献し、提出されたバージョンを読んで承認しました。

資金

この作品は、INIAからの助成金PL-015N-15156と、「Comisión Sectorial de Investigación Científica」（CSIC）からの「Programa de Iniciación a la Investigación2017」からの158によって資金提供されました。 MCとRDCは、博士号奨学金を通じて、それぞれ「国立研究・技術革新機関」（ANII）とINIAからの支援を認めています。 FGは、モビリティグラントMOV_CA_2018_1_150021を通じてANIIからのサポートを認めています。

利益相反声明

著者らは、この研究は潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。

レビュアー TSは、著者PPの一人との過去の共著者をハンドリングエディタに宣言しました。

謝辞

著者は、INIAのYisell PerdomoとCecilia Monesiglio、CAHFSのKaren SverlowとJuliann Beingesserに技術支援を感謝しています。

補足資料

この記事の補足資料はオンラインで見つけることができます: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01240/full#supplementary-material

図Ｓ１／全長Ｏｒｆ１Ａ Ｂ（Ａ）、全長ＯＲＦ２（Ｂ）、全長Ｏｒｆ１Ａ（Ｃ）、および部分Ｏｒｆ１Ｂ（Ｄ）の分析によって得られた最大クレード信頼性木（Ｍｃｃｔ）。 枝の色は祖先が循環した最も可能性の高い国を表し、枝には事後確率値が表示され、各ノードの数字は95％HPD間隔の各クレードの起源年を表します。 副系統はラベルで示される。

1. ^http://iqtree.cibiv.univie.ac.at