Establishment of A Competitive Binding Assay Identifying the Different Characteristics of Neutralizing Epitopes of Hepatitis E Virus

Abstract

Aims:To confirm the different characteristics of genotype-specific and common neutralizing epitopes of Hepatitis e virus(HEV). メソッド: 競合結合アッセイは、既知の遺伝子型共通中和モノクローナル抗体（mab）3G1と5G5だけでなく、遺伝子型特異的中和mab2B1と4C5で確立されました。 ＨＥＶ ＯＲＦ２遺伝子型１由来の組換えｐ１ ６ ６Ｗ０ １および遺伝子型４由来のｐ１ ６ ６ＣＨＮを被覆抗原として使用して、ｍＡｂが独立した、類似した、または重複するエピトープ ｍａｂを産生し，精製し，西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共役させた。 HRP共役2B1はp166w01でのみ反応するが、p166chnでは反応しない、HRP共役4C5はp166chnでのみ反応するが、p166w01では反応しない、HRP共役3G1と5G5はp166w01とp166chnの両方で反応することができる。 したがって、競合結合アッセイは、p166w01およびp166chn抗原を使用して連続的に行われた。 結果および結論：競合結合アッセイの結果は、HRP結合2B1のp166w01への結合が5G5または3G1によって阻害されないことを明らかにした。 同様に、HRP結合4C5のp166chnへの結合は、5G5または3G1によって阻害されなかった。 しかし、mab5G5および3G1は、p166w01およびp166chnへの相互の結合をブロックし、共通および遺伝子型特異的中和mabが独立したエピトープを認識す

©2018S.Karger AG,Basel

はじめに

E型肝炎ウイルス（HEV）は、主に経口経路を介して伝達され、ヒト急性E型肝炎を引き起こす非活性型の陽性鎖RNAウイル HEV感染は、生命障害、重度の急性肝炎、移植された臓器および免疫抑制患者における慢性感染、および妊婦における高い死亡率などの有害な予後につ ヒトで確認された感染に加えて、Hevは動物にも感染し、動物からヒトに伝染する可能性があり、先進国でのE型肝炎感染の発生率も大幅に増加してい これらの知見は、HEVが世界中の公衆衛生上の脅威をもたらすことを示している。

一つの血清型が認識されているが、世界中の異なる地域に由来するHEV分離株は、4つの主要な遺伝子型に分類することができる。 遺伝子型1および2のhevは、疫学的、抗原的、および免疫原性の特徴において、遺伝子型3および4とは異なる。

これまで、IN vitro培養系のHEV構造タンパク質を中心とした抗原エピトープのキャラクタリゼーションに関する研究は行われていない。 porf2はORF2によってコードされる主要なHEVの構造蛋白質であり、ウイルスのゲノムの1つの3つの重複の開いた読書フレーム(Orf)である。 Porf2の優勢な免疫原性領域は、ワクチン開発の主な標的であったC末端2/3領域に局在している。

以前の研究では、遺伝子型4由来のE型肝炎ワクチンp179（ORF2タンパク質の439-617アミノ酸）と遺伝子型1由来のp239（ヘコリン）との間に免疫原性の差が存在することが明らかにされており、その差はHEV遺伝子型特異的エピトープの存在に起因する可能性がある。 遺伝子型1に由来するp166sar（ORF2タンパク質の452-617アミノ酸）と遺伝子型4に由来するp166chnでそれぞれ免疫マウスで生産されたモノクローナル抗体（mab）は、ge notype特異的エピトープ（複数可）の存在を確認するために使用されている。 2つの遺伝子型共通の中和mab、3G1および5G5のほかに、2つの遺伝子型特異的な中和mab、2B1および4C5も得られた。 P166sarに対する2B1は、遺伝子型1および2組換えタンパク質に特異的に結合し、in vitroで遺伝子型1および2株のみを中和することができた; P166chnに対する4C5は、遺伝子型3および4組換えタンパク質に対して特異的に免疫反応し、遺伝子型3および4株のみを中和したが、p166sarに対する3G1およびp166chnに対する5G5は、遺伝子型1-4組換えタンパク質および中和された4株に結合することができた。 HEVの遺伝子型共通および遺伝子型特異的中和エピトープの異なる特性のさらなる研究のために、競合結合アッセイは、mabによって認識されるエピトープは、独立した、類似、または重複しているかどうかを確認するために、mab2B1、3G1、4C5、および5G5を使用して開発されました。

材料および方法

組換えタンパク質

組換えp166はporf2の切断タンパク質であり、ヌクレオチド配列は以下のHEV株に由来した：W01（遺伝子型1、JX857689）およびChina-9829（遺伝子型4、AY789225）。 組換えプラスミドを構築し，大腸菌で発現させた。 2つのHisタグ付きp166タンパク質は、それぞれp166w01およびp166chnとして指定された。

mAb産生

上記の4つの中和mab、2B1、3G1、4C5、および5G5の合計は、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を開発するために使用されました。 2B1と3G1はp166sarに対して提起された;4C5と5G5はp166chnに対して提起された。 ＭＡｂは、１ ０ ６個のハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入することによって産生され、ＭＡｂを含む腹水を７〜１ ０日後に回収し、濾過し、遠心分離し、−８ ０℃で保＜６ ４ ９ ７＞＜１ ２ ５ ８＞ＭＡｂの精製＜４ ７ ８＞＜１ ４ １＞ｍａｂ腹水液は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。 抗体を含む画分を、固定化されたプロテインGから酸性溶出緩衝液（0.1Mグリシン-HCl、pH2.8）を使用して収集し、次いで280nmで測定した。280nmでの吸光度（A280）を使用してmAbを大まかに定量することができる。 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて，ウシ血清アルブミンを用いて精製画分を確認し定量した。

ワサビペルオキシダーゼのmabへのカップリング

精製mabを100mM炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（pH9.3）に対して4℃で一晩透析した。 抗体は、製造業者の説明書（ＫＰＬ）により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された。 約1.5mgのHRPを0.5mgのmAbと0.5mLのhrpコンジュゲーションバッファーの全容量で混合し、室温で1時間静かに攪拌した。

異種p166抗原に対するHRP結合mabの交差反応性

ELISA法を適用して、Hrp結合mabとP166w01およびp166chn抗原との交差反応性を確認した。 簡単には、マイクロプレートのウェルは、それぞれ100ngのp166w01とp166chn抗原でコーティングされ、2時間37℃でインキュベートされたこれは、コーティングされた抗原の除去に続いていた;200μ lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.1％ウシ血清アルブミンを含むウェルに加え、その後、マイクロプレートは、穏やかな振とうと室温でインキュベートされた。 ０ ５％Ｔｗｅｅｎ−２ ０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで２回洗浄した。 １％カゼインＰＢＳ中で１：４ ０ ０〜１：２ ５，６ ０ ０の範囲のＨＲＰ結合ＭＡｂの連続２倍希釈物を、対応するウェル中に添加し、続いて３ ７℃で４ ５分間のインキュベーションを行った；カゼインＰＢＳを、ＰＢＳＴで５回洗浄することによって除去した。 テトラメチルベンジジン液体基質は、37℃で10分間インキュベーションのための発色のために添加された。 最後に、各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、６ ３ ０ｎｍの参照波長で４ ５ ０ｎｍで読み取った。

抗原およびmab力価の決定

抗原およびmabの力価をELISAを用いて決定した。 最初に、１％カゼインＰＢＳ中で１：４ ０ ０〜１：２ ５，６ ０ ０の範囲のＨＲＰ結合ＭＡｂの連続２倍希釈を調製し、次いで、ｐ１ ６ ６Ｗ０ １またはｐ１ ６ ６ＣＨＮ抗原の連続希釈でプレコートされたウェル 続いて３ ７℃で４ ５分間インキュベーションし、ＰＢＳＴで５回洗浄することにより未結合のｍＡｂを除去した。 テトラメチルベンジジン液体基質は、10分のインキュベーションのための色の開発のために37℃で添加された。 最後に、各ウェルのＯＤを、６ ３ ０ｎｍの参照波長で４ ５ ０ｎｍで読み取って、亜飽和化している希釈を決定し、６ ３ ０ｎｍの参照波長で４ ５ ０ｎｍで約１．

競合結合アッセイ

HEVの共通および遺伝子型特異的中和エピトープの異なる特性は、共通および遺伝子型特異的中和mabで確立ペアワイズ競合結合ア この方法は、ｐ１ ６ ６Ｗ０ １およびｐ１ ６ ６ＣＨＮをそれぞれ被覆抗原として使用し、ｈｒｐ結合ＭＡｂの２倍の濃度および飽和濃度の非結合ＭＡｂの混合物を被覆ウェルに加 ＯＤを４ ５ ０ｎｍで、６ ３ ０ｎｍの参照波長で測定した。 阻害率は、式：１ ０ ０×を使用して計算した。 阻害率が50％を超える場合、競争は陽性と評価された。

結果

異種p166抗原に対するHRP結合mabの交差反応性

ELISA法を適用して、P166w01およびp166chn抗原に対するHRP結合mabの交差反応性を評価した。 結果は、1:400から1:25,600までの希釈でHRP共役2B1はp166w01とのみ反応したが、p166chnとは反応せず、1:400から1:25,600までの希釈でHRP共役4C5はp166chnとのみ反応したことを明らかにした。 対照的に、１：４ ０ ０から１：２ ５，６ ０ ０までの希釈でのＨＲＰ結合３Ｇ１および５Ｇ５は、２つのｐ１ ６ ６タンパク質とよく反応した（図１ ０Ａ）。 1). これらの観察は、以前の知見と同様であり、２Ｂ１および４Ｃ５は遺伝子型特異的ｍＡｂであり、一方、３Ｇ１および５Ｇ５は遺伝子型共通ｍＡｂである。

競合的結合アッセイのためのp166W01抗原およびHRP共役mAb力価の決定

p166W01抗原を使用して、mAb2B1、3G1、および5G5の競合的結合アッセイを確立した;mAbおよび抗原の適切な力価をELISAを用いて決定した。 表1に示すように、正方形滴定後、p166w01抗原の希釈が1:400であった場合、HRP共役2B1は1:6,400であり、平均OD値は1.0に近いものであった。 一方、表２に示すように、抗原の希釈が１：４ ０ ０であった場合、ｈｒｐ結合５Ｇ５およびＨＲＰ結合３Ｇ１は、それぞれ１：６，４ ０ ０および１：１ ２，８ ０ ０であり、平均ＯＤ値は１．

競合結合アッセイのためのp166chn抗原およびHRP共役mAb力価の決定

p166chn抗原を使用して、mab4C5、3G1、および5G5の競合結合アッセイを確立し、mabおよび抗原の適切な力価もELISAを用いて決定した。 表３に示すように、２乗滴定後、ｐ１ ６ ６ＣＨＮ抗原の希釈が１：８ ０ ０であった場合、ＨＲＰ結合４Ｃ５は１：６，４ ０ ０であり、平均ＯＤ値は１． 一方、表４に示すように、抗原の希釈が１：８ ０ ０であった場合、ｈｒｐ結合５Ｇ５およびＨＲＰ結合３Ｇ１の希釈は、それぞれ１：６，４ ０ ０および１：１ ２，８ ０ ０であり、平均ＯＤ値は１．

p166w01へのmabの結合の阻害

阻害の結果を表5に示す; P166w01抗原へのHRP共役2B1の結合は、68％の阻害と非共役2B1によって阻害された。 ２Ｂ１とｍＡｂ５Ｇ５と３Ｇ１との間に有意な阻害はなかった（２ ７および３ ０％）。 より完全な阻害は、異種mab3G1および5G5から得られ、抗原へのHRP-3G1の結合が5G5によって61％阻害で阻害され、抗原へのhrp共役5G5が3G1に Hrp-3G1およびHRP-5G5のp166w01抗原への結合もまた、それ自体によってほぼ完全に阻害された（81および80％の阻害）。 これらの結果は、3G1と5G5は、同じエピトープまたは重複エピトープを共有することができることを示唆している、まだ2B1は、おそらく別のエピトープ

＜４ ７ ８＞＜１ ４ １＞阻害の結果を表５に示す：ＨＲＰ−４Ｃ５のｐ１ ６ ６ＣＨＮへの結合は、非結合４Ｃ５によって阻害され、６ ９％の阻害であったが、他の２つの非結合ｍＡｂ３Ｇ１およ しかし、より高い阻害率は、抗原へのＨＲＰ結合ＭＡｂ３Ｇ１および５Ｇ５結合から得られ、６ ５および７ ６％の阻害で非結合５Ｇ５および３Ｇ１によって阻害された。 HRP共役3G1とhrp共役5G5p166chn抗原への結合もほとんどそれ自体によって阻害されました。 これらの結果はまた、3G1と5G5が同じエピトープまたは重複エピトープを共有し、4C5はおそらく異なるエピトープを認識することを示唆している。

ディスカッション

新規豚HEVが最初に単離されて以来、抗HEV抗体は多くの動物で報告されており、動物とヒトの間でHEV感染が明らかになり、これは動物からヒトに伝染する可能性がある。 Ｅ型肝炎の罹患率および死亡率の減少は，ワクチンの予防および有効な診断に依存した。 ＨＥＶのエピトープの知識は，ワクチンの調製と診断開発に不可欠であった。 血清中の特異的抗体の検出は主な診断法の一つであり、抗体検出のための血清学的アッセイが増えている。 しかしながら、特異的抗体を検出するために使用されるアッセイは、感度においてかなり異なる。 遺伝子型1または2抗原に基づくいくつかの市販の診断アッセイは、遺伝子型3または4分離株に対する血清抗体を検出するために失敗します。 ほとんど異なった診断試金のnoncorrespondenceの基になるメカニズムについて知られていません。

現在、IN vitro細胞培養システムはHEVの研究にはまだ利用できません。 したがって、ほとんどの免疫原性部位を含むporf2は、コンフォメーション依存性の文字で、HEV免疫学的研究のために広く使用されています。 中和抗体および保護抗体を誘発する免疫原の構造的基礎は、E型肝炎ワクチン開発の主な標的である中和エピトープである。 我々は以前にp166タンパク質、porf2の切り捨てられたタンパク質は、HEV中和エピトープ（複数可）をモデル化することができ、p166に対して発生した抗体は、HEVの異 さらに、遺伝子型1HEV由来のe型肝炎p239ワクチンは、流行性HEV分離株が遺伝子型4である中国江蘇省で実施された第3相臨床試験で有効であった。 これらの結果は，ＨＥＶの異なる遺伝子型内に共通の中和エピトープが存在することを明らかにした。 一般的な中和エピトープのほかに，ｍａｂの調製および特性評価のために遺伝子型-ｓｐｅ ｃｉｆｉｃエピトープも存在することが確認されている。

さらに、共通および遺伝子型特異的中和エピトープの特性を識別するために、競合阻害アッセイは、共通の中和mab、3G1および5G5、および遺伝子型特

最初に、mAb3G1、2B1、5G5、および4C5の腹水を産生し、精製し、HRPと抱合させた。 ＥＬＩＳＡ法を適用して、ＨＥＶ ｐ１ ６ ６の異なる遺伝子型とＨＲＰ抱合ｍＡｂの結合ａ Ｆフィニティを比較した。 結果は、HRP-conjugat ed2B1のみ遺伝子型1p166w01ではなく、p166chnと反応したことを明らかにした。 同様に、HRP共役4C5はp166chnとのみ反応した。 対照的に、HRP共役3G1と5G5は2遺伝子型p166タンパク質に対してよく反応した。 したがって、競合的結合アッセイは、遺伝子型1および4HEV p166抗原に基づいている。 競合結合アッセイの結果は驚くべきことではない。 2B1のp166w01への結合はそれ自体で競合するだけであり、3G1および5G5はp166w01への結合について互いに競合することができる。 さらに、４Ｃ５のｐ１ ６ ６ＣＨＮへの結合は、同様に単独でのみ競合したが、３Ｇ１および５Ｇ５は、ｐ１ ６ ６ＣＨＮへの結合について互いに競合することができた。 これらの知見は、3G1と5G5が同じまたは重複するエピトープを認識し、2b1と4C5が異なるエピトープを認識することを示した。

これは、HEVの遺伝子型共通および遺伝子型特異的立体配座中和エピトープの異なる特性を調査する最初の研究です。 我々は、共通および遺伝子型特異的中和エピトープが独立している可能性があることを実証した。 この発見は、異なる診断アッセイの低一致の根底にあるメカニズムを実証するために非常に有益です。 さらなる研究は、診断開発とワクチン調製の有効性におけるHEVの中和エピトープの異なる特性を解明するために非常に重要である。

謝辞

この研究は、安徽医科大学の博士科学研究財団（No.0110037101）によって支援されました。

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