단백질 정화
출발 물질의 선택은 정화 공정 설계의 핵심입니다. 식물 또는 동물에서는,특정한 단백질은 일반적으로 몸 전체에 균질하게 배부되지 않습니다;다른 기관 또는 조직에는 단백질의 더 높거나 더 낮은 농도가 있습니다. 가장 높은 농도의 조직 또는 기관만을 사용하면 주어진 양의 정제 된 단백질을 생산하는 데 필요한 부피가 감소합니다. 만약 단백질이 낮은 양으로 존재하거나,높은 가치를 가지고 있다면,과학자들은 원하는 단백질을 대량으로 생산하는 세포를 개발하기 위해 재조합 유전자 기술을 사용할 수 있다(이것은 발현 시스템으로 알려져 있다). 재조합 발현은 단백질을 그의 태그 또는 패 혈성 연쇄상 구균 태그에 의해 태그가 지정되어 정화를 촉진하여 필요한 정제 단계의 수를 줄일 수 있습니다.
분석적인 정제는 일반적으로 단백질을 분리하기 위하여 3 개의 재산을 이용합니다. 첫째,단백질은 산도 등급 겔 또는 이온 교환 컬럼을 통해 실행하여 자신의 등전점에 따라 정제 할 수있다. 둘째,단백질은 크기 배제 크로마토 그래피 또는 나트륨 도데 실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동)분석을 통해 크기 또는 분자량에 따라 분리 될 수 있습니다. 단백질은 제 2 페이지를 사용해서 수시로 순화되고 단백질 신원을 설치하기 위하여 펩티드 질량 지문에 의해 그 때 분석됩니다. 이것은 과학적인 목적을 위해 아주 유용하 단백질을 위한 탐지 한계는 현재에는 아주 낮 단백질의 나노그램 양은 그들의 분석을 위해 충분합니다. 셋째,단백질은 고성능 액체 크로마토 그래피 또는 역상 크로마토 그래피를 통해 극성/소수성에 의해 분리 될 수 있습니다.
일반적으로 단백질 정제 프로토콜은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 크로마토 그래피의 기본 절차는 다양한 재료로 포장 된 열을 통해 단백질을 포함하는 용액을 흐르게하는 것입니다. 다른 단백질은 칼럼 재료와 다르게 상호 작용하며,따라서 칼럼을 통과하는 데 필요한 시간 또는 칼럼에서 단백질을 용리하는 데 필요한 조건에 의해 분리 될 수 있습니다. 보통 단백질은 280 나노미터에 그들의 흡광도에 의해 란 떨어져 오고 있는 때 검출됩니다. 많은 다른 크로마토그래피 방법이 존재합니다:
크기 제외 크로마토그래피 편집
크로마토그래피는 다공성 겔을 사용하여 용액 또는 변성 조건에서 단백질을 분리하는데 사용될 수 있습니다. 이 기술을 크기 제외 크로마토 그래피라고합니다. 원리는 작은 분자가 다공성 매트릭스에서 더 큰 부피를 통과해야한다는 것입니다. 결과적으로,크기의 특정 범위의 단백질은 겔 컬럼의 다른 쪽 끝에서 수집되기 전에 용리액(용매)의 가변 부피를 필요로 할 것이다.
단백질 정제의 맥락에서,용리액은 일반적으로 다른 시험관에 풀링된다. 순화할 단백질의 잴 수 있는 자취를 포함하지 않는 모든 시험관은 버려집니다. 따라서 나머지 용액은 단백질 정제 및 다른 유사 크기의 단백질로 만들어집니다.
전하 또는 소수성에 기초한 분리편집
소수성 상호 작용 크로마토 그래피 편집
힉 매체는 양친 매성이며,소수성 및 친수성 영역 모두를 가지며,표면 소수성에 기초한 단백질의 분리를 허용한다. 표적 단백질 및 그 생성물 골재 종은 상이한 소수성 특성을 갖는 경향이 있으며,이를 통해 제거하는 것은 관심있는 단백질을 더욱 정화시킨다. 게다가,이용된 환경은 전형적으로 다른 착색인쇄기 기술 보다는 보다 적게 가혹한 변성 조건을 채택해,따라서 그것의 고유 및 기능적인 국가에 있는 관심사의 단백질을 보존하는 것을 돕. 순수한 물에서는 수지와 단백질의 소수성 영역 사이의 상호 작용이 매우 약할 것이지만,이 상호 작용은 높은 이온 강도 완충액에서 단백질 샘플을 수지에 적용함으로써 향상됩니다. 완충액의 이온 강도는 소수성을 감소시키기 위해 단백질을 용리시키기 위해 감소된다.
이온교환 크로마토그래피편집
이온교환 크로마토그래피 입니다. 사용할 열은 해당 유형 및 충전 강도에 따라 선택됩니다. 음이온 교환 수지는 양전하를 가지며 음전하를 띤 화합물(음이온)을 유지하고 분리하는 데 사용되는 반면 양이온 교환 수지는 음전하를 띠며 양전하를 띤 분자(양이온)를 분리하는 데 사용됩니다.
분리가 시작되기 전에 버퍼는 컬럼을 통해 펌핑되어 대향 하전 된 이온을 평형시킨다. 샘플을 주입하면 용질 분자는 각각 수지의 결합 부위에 대해 경쟁하기 때문에 완충 이온과 교환됩니다. 각 용질에 대한 보유 기간은 전하의 강도에 따라 다릅니다. 가장 약하게 충전 된 화합물이 먼저 용출되고 연속적으로 더 강한 전하를 가진 화합물이 뒤 따릅니다. 분리 메커니즘,산도,버퍼 유형,버퍼 농도 및 온도의 특성 때문에 모든 분리를 제어에 중요 한 역할을 한다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정제에 사용하기 위한 매우 강력한 도구이며 분석 및 예비 분리 모두에 자주 사용됩니다.
자유 흐름-전기공학편집
자유 흐름 전기 영동은 직교 전기장을 사용하여 층류 버퍼 스트림에서 예비 단백질 분리를 허용하는 담체가없는 전기 영동 기술입니다. 산도 그라데이션을 이용하여,그 예를 들어 양각제에 의해 유도 될 수있다,이 기술은<0.02 델타 파이의 해상도까지 단백질 이소 형태를 분리 할 수 있습니다.
선호도 크로마토그래피편집
친 화성 크로마토그래피 자주 응용 프로그램 특정 수 지를 활용 하는 분자 형태에 따라 분리 기술입니다. 이 수지에는 분리될 화합물을 위해 특정한 그들의 표면에 붙어 있는 리간드가 있습니다. 가장 자주,이러한 리간드는 항체-항원 상호 작용과 유사한 방식으로 기능합니다. 이”잠금 및 키”는 리간드와 그 표적 화합물 사이에 맞으면 매우 특이적이며 종종 단일 피크를 생성하는 반면 샘플의 다른 모든 것은 확인되지 않습니다.
많은 막 단백질은 당 단백질이며 렉틴 친 화성 크로마토 그래피에 의해 정제 될 수 있습니다. 세제 가용화 된 단백질은 공유 부착 된 렉틴을 갖도록 변형 된 크로마토 그래피 수지에 결합 할 수 있습니다. 렉틴에 결합하지 않는 단백질은 씻어 낸 다음 특별히 결합 된 당 단백질은 렉틴 결합 부위에서 결합 된 당 단백질과 경쟁하는 고농도의 설탕을 첨가하여 용출 할 수 있습니다. 일부 렉틴은 당과 경쟁하기 어려운 당 단백질의 올리고당에 높은 친 화성 결합을 가지며,결합 된 당 단백질은 렉틴을 변성시킴으로써 방출 될 필요가있다.
면역아피도 크로마토그래피편집
면역아피도 크로마토그래피는 항체-항원의 특이 적 결합을 사용하여 표적 단백질을 선택적으로 정제한다. 이 절차는 단백질을 고체 기질(예:다공성 비드 또는 막)에 고정시키는 것을 포함하며,그 다음 표적을 선택적으로 결합하는 반면 다른 모든 것은 흐릅니다. 표적 단백질은 산도 또는 염분을 변화시킴으로써 용출 될 수있다. 고정화 된 리간드는 항체(예:면역 글로불린 지)또는 단백질(예:단백질 에이)일 수 있습니다. 이 방법은 태그에 엔지니어링을 포함하지 않기 때문에 천연 소스의 단백질에 사용할 수 있습니다.
태그가 지정된 단백질의 정제
단백질에 태그를 지정하는 또 다른 방법은 항원 펩타이드 태그를 단백질에 조작 한 다음 칼럼 또는 고정화 된 항체로 코팅 된 느슨한 수지로 배양하여 단백질을 정제하는 것입니다. 이 특정 절차를 면역 강하라고합니다. 면역 침강은 일반적으로 원하는 단백질 만 결합하는 매우 특정한 상호 작용을 생성 할 수 있습니다. 순화한 표를 붙인 단백질은 해결책에 있는 다른 단백질에서 그 때 쉽게 분리되고 청결한 해결책으로 나중에 다시 용출될 수 있습니다.
태그가 더 이상 필요하지 않으면 프로테아제에 의해 분해 될 수 있습니다. 이것은 수시로 꼬리표와 단백질 사이 프로테아제 분열 위치를 설계하는 관련시킵니다.
고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피는 컬럼을 통해 용질을 더 빨리 구동하기 위해 고압을 가하는 크로마토그래피의 한 형태입니다. 이 확산이 제한되고 해상도가 향상되는 것을 의미한다. 가장 일반적인 형태는 열 재료가 소수성 인”역상”입니다. 단백질은 아세토니트릴과 같은 유기 용매 양의 증가의 기온변화도에 의해 용출됩니다. 단백질은 소수성에 따라 용출됩니다. 정제 후 단백질은 휘발성 화합물만을 포함하는 용액에 있으며 쉽게 동결 건조 될 수 있습니다. 따라서 자발적으로 재폴드되지 않는 단백질에는 적용되지 않습니다.