Clostridium difficile toxin b

når den katalytiske treoninresten av glukosyltransferase deaktiverer en familie av små Gtpaser, f. eks. 5). Rho induserer aktiviteten til aktinstressfibre. Rac-proteiner styrer aktivitetene til membranruffling og NADPH-oksidase nøytrofil. Cdc42 regulerer F-aktinfilamentdannelsen i filopodi.

Cytotoksisitetrediger

Flere studier har vist at tilstedeværelsen Av TcdB i pattedyrceller fører til raske endringer innen cellemorfologi og cellesignalering. Innen kort tid har celler utseende av plakk med små doser Av TcdB og TcdA. I tillegg er celledød en stor innvirkning av disse toksinene etter at cellene har blitt beruset. En undersøkelse Av Donta et al., videresendt At TcdB har alvorlige konsekvenser i andre pattedyrceller som ovarieceller fra kinesisk hamster, humane cervikale epitelceller, mus adrenalceller, rotte hepatocytter og rotte astrocytter (Fig.3).

den cytotoksiske aktiviteten er basert på celletyper, som kan variere fra 4 ganger til 200 ganger. Vanligvis, når celler er infisert Med TcdB, mister de ikke bare sin strukturelle integritet, men også reduksjon Av F-aktinfilamenter. Cellerunde med TcdB tar ikke lenger enn 2 timer(Fig. 4), men så langt som celledød går, kan det ta omtrent 24 timer. Med Hensyn Til Clostridium difficile-associated diare (CDAD), er effektene av cytopaticitet mer kritiske enn faktisk celledød fordi når celler mister integriteten til cytoskelettaktinfilamentet, mister de også sin normale funksjon.

Effekter På små GTPasesEdit

Årsaken Til cytotoksisk aktivitet av TcdB i vertscellen er hovedsakelig mediert via reseptorendocytose. Syreendosomer tillater toksin B å komme inn i cytosolen. Dette fenomenet foregår ved en bindende reseptorregion, som gjør det mulig for toksin å komme inn i vertsceller. Gjennom tilgjengeligheten av vertscellens cytosol deaktiverer TcdB de små Gtpasene(Fig. 5), f. eks Rho familiemedlemmer rac og Cdc42 ved prosessen med glykosylering av treonin 35 I Cdc42 Og Rac, og treonin 37 I Rho. Disse Rho GTPases finnes allestedsnærværende i cytosol av eukaryote celler som er ansvarlige for organisasjonen av actin cytoskelettet fordi toksinene i cytosol forårsaker kondensering av aktinfilamenter som følge av cellerundering og membranblebbing (Fig. 3), som til slutt fører til apoptose. TcdB forårsaker kritiske endringer i celledynamikk og morfologi. Figur 3 viser den sannsynlige effekten av toksin B på en celles overflate; membranblebbing (svarte piler). I tillegg inaktiverer Tcdb Rho Gtpaser. Som en konsekvens forstyrres cellecelleforbindelser, noe som forbedrer epitelpermeabiliteten av toksin B og væskeakkumulering i lumen. Dette er et av de viktigste årsaksmidlene ved kontrahering Av Clostridium difficile-assosiert diare (CDAD) (Fig. 5).

videre er hydrolysehastigheten Ved TCDB AV UDP-glukose omtrent fem ganger større Enn TcdA. Flere studier har indikert At Rho utviser posttranslasjonell modifikasjon gjennom prenylering og karboksymetylering, som forekommer i den cytoplasmatiske siden av plasmamembranen, og dermed utvekslingen AV GTP til BNP. Når TcdB binder Seg Til Rho og andre Små Gtpaser, hydrolyserer GTP TIL BNP, noe som fører TIL GTP-bundet (aktiv) TIL BNP-bundet (inaktiv) (Fig. 5). I tillegg reguleres denne utvekslingsaktiviteten av guaninfaktorer i cellens cytosol.

Forstyrrelser på signalbanerrediger

den cellulære reguleringen Av Rho, Rac og Cdc42 har effekter utenfor nærheten av aktinfilamentene i cytoskelettet (Fig. 4), er Disse små Gtpasene innlemmet i cellesyklusen som regulerer signaler via mitogenaktiverte proteinkinasekinaser (MAPKKs). Noen fysiologiske deler av cellene som ikke er involvert i aktinfilamenter, kan ikke forårsake cellerundering eller celledød med en gang, men i nedstrømsveiaktivitet kan det føre til forverring av aktinfilamenter og til slutt celledød.

i 1993, en studie utført Av Shoshan et al., viste at celler Med TcdB endret fosfolipase A2-aktivitet. Dette var en uavhengig hendelse fra forstyrrelse av actin cytoskelettet. Shoshan et al., viste også At TcdB hemmet reseptorsignalaktiviteten ved å deaktivere Rho-proteinene via fosfolipase D.

poreformasjonrediger

TcdB får tilgang til det indre av cellen gjennom clathrin-mediert endocytose, når toksin B er en del av cytosolen, passerer glukosyltransferasen gjennom endosomalmembranen, noe som reduserer pH, induserer translokasjon og til slutt fører til morfologiske endringer av translokasjonsregionrester (958-1130). De hydrofobe områdene er innebygd i vertsmembranen for å danne porer som tillater glukosyltransferase-domener å passere gjennom. Når celler er infisert Med TcdB i et surt miljø, demper det toksiner og forårsaker formomarrangementer (Fig. 6). Som en konsekvens av sur pH viser TcdB klare forskjeller i original fluorescens av tryptofan, følsomhet for proteaser og hydrofobe overflater. En annen gruppe har vist at forsuring fører til konformasjonsendringer av toksinet og, enda viktigere, bidrar til å danne porer. En antatt translokasjonsregion (Fig. 2) utgjør ca 801-1400 aminosyrer, hvorav rester 958-1130 er hydrofobe og er ansvarlige for dannelsen av transmembrane porer. Et flertall av studiene brukte tcdb stamme 630 for å vise poreformasjonsaktiviteten Til c. difficile toksiner.

Indusert av pHEdit

for å se om effekter av proteolytisk spaltning av TcdB finner sted på celleoverflaten eller i sure endosomer, brukte studier Bafilomycin A1, som er kjent for å blokkere v-Type H+-Atpaser av endosomer. Dette reduserer surheten i endosomer. Den fysiologiske opptaksveien til TcdB forhindrer cytopatisk aktivitet ved TcdB. Når cellene var i sure forhold (pH 4,0) i 5 minutter etter binding TcdB til celleoverflaten ved 37 Grader Celsius, ble formomleggingene og avrundingen observert. Men når avrundede celler ble inkubert i en ekstra time i nøytral pH (7,0) med lignende parametere, ble det ikke observert noen cellerunding. Begge studiene viste at toksin B har en egenskap av proteolytisk spaltning, noe som er kritisk for tilgang til cytosol. Å ha et surt endosom pH fører til topologiske endringer Av TcdB (Figur 6).

genet som koder For tcdb-proteinet, tcdB, ligger innenfor kromosomområdet på 19,6 kb. Dette er kjent som locus of pathogenicity Eller PaLoc (Figur 2). Den åpne leserammen (ORF) for tcdB er 7,098 nukleotider i lengde. Det er viktig å nevne at-i tillegg til de store giftgenene I PaLoc-regionen – er det tre andre tilleggsgener som koder i PaLoc-regionen: tcdR (L), Tcdc (R) og tcdE i midten. Disse genene bidrar til å regulere tcda og TcdB-uttrykk. De bidrar også til å utskille eller frigjøre giftstoffer fra cellen. Kodingsgenet tcdE, som ligger mellom tcdB og tcdA, er analogt med holinproteiner, og det foreslås derfor at tcdE fungerer som et fasilitatorgen som forbedrer frigivelsen eller sekresjonen Av TcdA og TcdB, og dermed øker permeabiliteten til vertscellemembranen.

det er forskjellige plasmidstørrelser Av c. difficile. De påviste molekylvektene varierer fra 2, 7×106 til 100×106, men plasmid-størrelser viser ingen korrelasjon med toksisitet. For å oppdage toksin b-nivået I c. difficile, bruker klinikere i stor grad cellekulturanalyser avledet fra avføringsprøver fra pasienter med PMC. Cellekulturanalysen regnes som en «gullstandard»for å oppdage toksisitet I c. difficile fordi en liten mengde toksin B er i stand til å forårsake cellerundering (Fig. 4) det er derfor en stor fordel ved kliniske laboratorier å korrelere MED CDAD forårsaket Av TcdB. Selv om cytotoksisk aktivitet av store clostridiale toksiner (LCTs) ble funnet I pmc pasient avføringsprøver, toksin B-aktivitet hadde mer skadelige cytotoksiske effekter i forhold til toksin A. derfor er aktiviteten av toksin A dempet når den ikke er isolert fra toksin B. påvisning Av c. difficile toksisitet er ekstremt følsom, men ved hjelp av cellekulturanalysen tillater kliniske laboratorier å overvinne utfordringen.; bruk av doser så lite som 1 pg / mL toksin B er nok til å forårsake cellerundering. Dette er den største fordelen ved bruk av kulturvevsanalysen for å oppdage toksisitet hos PMC-pasienter. Selv om kliniske laboratorier har forsøkt å bruke en analyse mikrotiterplate enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og andre teknikker for å oppdage cytotoksisk aktivitet av toksin B i avføring AV PMC-pasienter, er resultatene ikke like nøyaktige som de der cellekulturanalyser ble brukt.

produksjonsfaktorrediger

ved å tilsette antimikrobielle, f. eks. clindamycin, i kulturvekstmediet, har studier vist at den cytotoksiske aktiviteten i c. difficile kulturer øker med 4-8 ganger. Videre, å vite hvilken rolle antibiotika på årsakene TIL PMC, fokuserte mange tidligere studier på effekten av antimikrobiell produksjon av toksiner. Som et resultat, studier var i stand til å konkludere med at subinhibitory natur vancomycin og penicillin nivåer var økende toksin produksjon i kulturer Av c. difficile. Mengden toksinproduksjon var korrelert med bruken av vekstmedium for organismer. En annen studie viste at de høye nivåene Av toksinproduksjon Av TcdB ble observert i komplekse medier som hjerne-og hjerteinfusjonsbuljong. Høye nivåer av toksiner ble produsert med isolering av svært virulente. Omvendt ble lave nivåer av toksiner produsert med isolering av svakt virulent. Dermed viser det seg at produksjonen av toksiner var samregulert. Selv om mekanismen bak miljøets involvering i å modulere signalene som uttrykker toksinene ikke er forstått, har in vitro studier vist at ekspresjon av toksin styrkes ved katabolitt undertrykkelse og stress, for eksempel antibiotika. En annen studie har vist at begrensning av biotin i godt karakterisert medium øker produksjonen Av TcdB med 64 ganger og TcdA med 35 ganger. Dette ble gjort Med c. difficile og doser biotin så små som 0.05 nM. Flere andre tidlige studier har argumentert mot teorien om at produksjonen av toksin har noe å håndtere stress eller katabolitt undertrykkelse av enten toksin TcdA eller TcdB. Også mange studier sier hovedårsaken til forskjellene blant andre studier skyldes toksinproduksjon som ikke forekommer med Alle isolater Av c. difficile.