Etablering Av En Konkurransedyktig Bindende Analyse Identifisere De Ulike Egenskapene Til Nøytraliserende Epitoper Av Hepatitt E Virus

Abstract

Mål: å bekrefte de ulike egenskapene til genotype-spesifikke og felles nøytraliserende epitoper av hepatitt e virus (HEV). Metoder: En konkurransedyktig bindingstest ble etablert med kjente genotype-felles nøytraliserende monoklonale antistoffer (mAbs) 3G1 OG 5G5 samt genotypespesifikke nøytraliserende mAbs 2B1 OG 4C5. Hev ORF2 rekombinant p166W01 avledet fra genotype 1 og p166Chn avledet fra genotype 4 ble brukt som belagte antigener for å avgjøre om mabene gjenkjenner uavhengige, lignende eller overlappende epitoper. mAbs ble produsert, renset og konjugert med pepperrot peroxidase (HRP). HRP-konjugert 2B1 kunne reagere bare med p166W01, men ikke p166Chn, HRP-konjugert 4C5 kunne reagere bare med p166Chn, men ikke p166W01, MENS HRP-konjugert 3G1 OG 5G5 kunne reagere både med p166W01 og p166Chn. Dermed ble konkurrerende bindingsanalyser utført suksessivt ved bruk av p166W01 og p166Chn antigen. Resultater og Konklusjon: resultatene av konkurrerende bindingsanalyser viste at bindingen AV HRP-konjugert 2B1 til p166W01 ikke kunne hemmes AV 5G5 eller 3G1. På samme måte kan bindingen AV HRP-konjugert 4C5 til p166Chn ikke hemmes AV 5G5 eller 3G1. Imidlertid blokkerte mAbs 5G5 OG 3G1 hverandres binding til p166W01 og p166Chn, noe som tyder på at vanlige og genotypespesifikke nøytraliserende mAbs gjenkjenner uavhengige epitoper.

© 2018 S. Karger AG, Basel

Innledning

Hepatitt E-virus (HEV) er et nonenveloped, positiv-strand RNA-virus som hovedsakelig overføres via oral rute og forårsaker akutt hepatitt E hos mennesker . HEV-infeksjon kan føre til skadelige prognostikere, for eksempel livssvikt, alvorlig akutt hepatitt, kronisk infeksjon i organtransplanterte og hos immunsupprimerte pasienter, og høy dødelighet hos gravide kvinner . I tillegg til bekreftet infeksjon hos mennesker, Smitter HEVs også dyr og kan overføres fra dyr til mennesker; forekomsten av hepatitt e-infeksjon i de utviklede landene har også økt betydelig . Disse funnene indikerer at HEV utgjør en folkehelsetrussel over hele verden .

selv om en serotype har blitt anerkjent, KAN HEV-isolater, avledet fra forskjellige områder over hele verden, klassifiseres i 4 store genotyper . Genotyper 1 og 2 skiller seg fra genotypene 3 og 4 i deres epidemiologiske, antigene og immunogene egenskaper .

hittil er forskning på antigenisk epitopkarakterisering hovedsakelig basert på HEV strukturelt protein for et in vitro kultursystem utilgjengelig . pORF2 er det viktigste HEV strukturelle proteinet kodet AV ORF2, som er 1 av 3 overlappende åpne leserammer (ORFs) av virusgenomet . Dominerende immunogene regioner av pORF2 har vært lokalisert I C-terminal 2/3-regionen, som var hovedmålene for vaksineutvikling .

Vår tidligere studie har avslørt eksistensen av en immunogenitetsforskjell mellom hepatitt e-vaksinen p179 (439-617 aminosyrer AV ORF2-proteinet) avledet fra genotype 4 og p239 (Hecolin) avledet fra genotype 1, forskjellen kan tilskrives tilstedeværelsen av HEV genotype-spesifikk epitop(er). Monoklonale antistoffer (mAbs) produsert i mus immunisert med henholdsvis p166sar (452-617 aminosyrer AV orf2-proteinet) avledet fra genotype 1 og p166Chn avledet fra genotype 4 har blitt brukt til å bekrefte tilstedeværelse av ge notype-spesifikk epitop (er). Foruten 2 genotype-felles nøytraliserende mabs, 3G1 OG 5G5, 2 genotype-spesifikke nøytraliserende mAbs, 2B1 OG 4C5, ble også oppnådd. 2B1 mot p166Sar kunne spesifikt binde seg til genotyper 1 og 2 rekombinante proteiner og nøytralisert bare genotyper 1 og 2 stammer in vitro; 4C5 mot p166chn immunoreagerte spesifikt mot genotyper 3 og 4 rekombinante proteiner og nøytraliserte bare genotype 3 og 4 stammer, MENS 3G1 mot p166Sar og 5G5 mot p166Chn kunne binde seg til genotyper 1-4 rekombinante proteiner og nøytraliserte 4 genotypestammer . For videre studier av de forskjellige egenskapene til genotype-felles og genotype-spesifikke nøytraliserende epitoper AV HEV, ble en konkurransedyktig bindende analyse utviklet ved hjelp av mAbs 2B1, 3G1, 4C5 og 5G5, for å bekrefte om epitoper anerkjent av mAbs er uavhengige, lignende eller overlappende.

Materialer Og Metoder

Rekombinante Proteiner

Rekombinant p166 var et avkortet protein av pORF2, nukleotidsekvensene ble avledet Fra følgende HEV-stammer: W01 (genotype 1, JX857689) Og Kina-9829 (genotype 4, AY789225). Rekombinante plasmider ble konstruert og uttrykt I Escherichia coli . De 2 His-merkede p166-proteinene ble betegnet som henholdsvis p166w01 og p166Chn.

mAb-Produksjon

totalt 4 nøytraliserende mAbs, 2B1, 3g1, 4c5 og 5g5 beskrevet tidligere, ble brukt til å utvikle en konkurransedyktig enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). 2B1 og 3G1 ble reist mot p166Sar; 4C5 OG 5G5 ble reist mot p166Chn . Mab-ene ble produsert ved å injisere 106 hybridomceller i bukhulen TIL EN BALB / c-mus; ascites-væske som inneholdt mab-er ble høstet etter 7-10 dager, filtrert, sentrifugert og lagret ved -80°C .

Rensing av mAbs

mab ascites-væsken ble renset ved hjelp av protein G-sepharose kolonneaffinitetskromatografi (Sigma, Tyskland). Fraksjoner inneholdende antistoff ble oppsamlet ved hjelp av den sure elueringsbufferen (0,1 m glysin-HCl, pH 2,8) fra det immobiliserte proteinet G og deretter bestemt ved 280 nm; absorbans ved 280 nm (A280) kan brukes til å kvantifisere mAbs grovt. Natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese ble brukt til å bekrefte og kvantifisere de rensede fraksjonene ved bruk av bovint serumalbumin .

Kobling Av Pepperrotperoksidase til mAbs

Rensede mAbs ble dialysert mot 100 mM karbonat/bikarbonatbuffer (pH 9,3) ved 4°c over natten . Antistoffer ble koblet til pepperrot peroxidase (HRP) av produsentens instruksjoner (KPL). Omtrent 1,5 mg HRP ble blandet med 0,5 mg mAb i 0,5 mL totalt VOLUM HRP-konjugeringsbuffer ved forsiktig omrøring ved romtemperatur i 1 time. blandingen ble etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter etter å ha tilsatt 10 µ av reduksjonsmidlet, og deretter ble 1 volum destillert glyserol tilsatt for lagring og videre bruk.

Kryssreaktivitet AV HRP-Konjugerte mAbs til Heterologt P166-Antigen

ELISA-metoden ble anvendt for å bekrefte KRYSSREAKTIVITETEN AV HRP-konjugerte mabs med p166W01 og p166Chn-antigen . Kort fortalt ble brønner av mikroplater belagt med henholdsvis 100 ng av p166W01-og p166Chn-antigenet inkubert i 2 timer ved 37°C. dette ble etterfulgt av fjerning av belagte antigener; 200 µ fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% bovint serumalbumin ble tilsatt i brønner, og deretter ble mikroplater inkubert ved romtemperatur med mild risting. To timer senere ble blokkeringsbufferen kassert, og brønnene ble vasket to ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween – 20 (PBST). Serielle 2-fold fortynninger AV HRP-konjugerte mAbs fra 1: 400 til 1: 25 600 i 1% kasein PBS ble tilsatt i tilsvarende brønner, etterfulgt av 45 min inkubasjon ved 37°C; kasein PBS ble fjernet ved vask 5 ganger med PBST. Tetrametylbenzidin flytende substrat ble tilsatt for fargeutvikling for inkubasjon ved 37°C i 10 min. Endelig ble den optiske tettheten (OD) av hver brønn lest ved 450 nm, med en referansebølgelengde på 630 nm.

Bestemmelse Av Antigen-Og mAb-Titere

titrene av antigen og mAbs ble bestemt ved BRUK AV EN ELISA. I utgangspunktet ble serielle 2-ganger fortynninger AV HRP-konjugerte mAbs fra 1: 400 til 1: 25,600 i 1% kasein PBS fremstilt, deretter tilsatt til brønner precoated med serielle fortynninger av p166W01 eller p166Chn antigen. Etterfulgt av en 45-min inkubasjon ved 37°C, ble ubundne mAbs fjernet ved vasking 5 ganger med PBST. Tetrametylbenzidin flytende substrat ble tilsatt for fargeutvikling for en 10-min inkubasjon ved 37°C. ENDELIG ble OD av hver brønn lest ved 450 nm, med en 630 nm referansebølgelengde, for å bestemme fortynningen som var submaturating og ga en OD-lesing på omtrent 1,0 ved 450 nm, med en 630 nm referansebølgelengde.

Konkurrerende Bindingsanalyse

de forskjellige karakteristikkene ved felles og genotypespesifikke nøytraliserende epitoper AV HEV ble undersøkt ved bruk av en parvis konkurrerende bindingsanalyse etablert med felles og genotypespesifikke nøytraliserende mAbs . Metodene var lik prosedyrene beskrevet ovenfor, bortsett fra at p166W01 og p166chn ble brukt som henholdsvis beleggingsantigen, og blandinger AV HRP-konjugert mAb ved to ganger konsentrasjonen og en mettet konsentrasjon av ukonjugert mAb ble tilsatt til de belagte brønnene. OD ble målt ved 450 nm, med en referansebølgelengde på 630 nm. Prosentvis hemming ble beregnet ved hjelp av formelen: 100 × . Konkurransen ble vurdert som positiv dersom hemmingsprosenten var mer enn 50%.

Resultater

Kryssreaktivitet AV HRP-Konjugerte mAbs til Heterologt P166 Antigen

ELISA-metoden ble anvendt for å evaluere kryssreaktiviteten AV HRP-konjugerte mabs til p166w01 og p166chn antigener. Resultatene viste AT HRP-konjugert 2B1 ved fortynninger fra 1: 400 til 1: 25,600 reagerte bare med p166W01, men ikke med p166Chn, OG HRP-konjugert 4C5 ved fortynninger fra 1: 400 til 1: 25,600 reagerte bare med p166Chn. I kontrast REAGERTE HRP-konjugert 3G1 og 5G5 ved fortynninger fra 1: 400 til 1: 25 600 godt med de 2 p166 proteinene (Fig . 1). Disse observasjonene var lik de tidligere funnene, 2b1 OG 4C5 er genotype-spesifikke mAbs, mens 3G1 OG 5G5 er genotype-vanlige mAbs .

Bestemmelse av P166w01-Antigen og HRP-Konjugerte mAb-Titere for Competitive Binding Assay

p166w01-antigen ble brukt til å etablere competitive binding assay AV mAbs 2B1, 3G1 OG 5G5; de riktige titrene av mAbs og antigen ble bestemt ved BRUK AV ELISA. Som vist i Tabell 1, etter kvadratisk titrering, da fortynningen av p166w01-antigenet var 1: 400, VAR HRP-konjugert 2B1 1: 6 400, gjennomsnittlig OD-verdi nær 1,0. I Mellomtiden, som vist I Tabell 2, da fortynningen av antigen var 1: 400, VAR HRP-konjugert 5G5 og HRP-konjugert 3G1 henholdsvis 1: 6 400 og 1: 12 800, og gjennomsnittlig OD-verdi var nær 1,0.

Bestemmelse av P166chn-Antigen og HRP-Konjugerte mAb-Titere for Konkurrerende Bindingsanalyse

p166Chn-antigen ble brukt til å etablere konkurransedyktig bindingsanalyse av MABS 4C5, 3G1 og 5G5, de riktige titrene av mAbs og antigen ble også bestemt ved BRUK AV ELISA. Som vist i Tabell 3, etter kvadratisk titrering, da fortynningen av p166chn-antigenet var 1: 800, VAR HRP-konjugert 4C5 1: 6 400, og gjennomsnittlig OD-verdi var nær 1,0. I Mellomtiden, som vist i Tabell 4, da fortynningen av antigenet var 1: 800, var fortynningene AV HRP-konjugert 5G5 og HRP-konjugert 3G1 henholdsvis 1: 6 400 og 1: 12 800; gjennomsnittlig OD-verdi var nær 1,0.

Hemming av Binding av mAbs til p166W01

resultatene av hemming er vist I Tabell 5; bindingen AV HRP-konjugert 2b1 til p166w01-antigen ble hemmet av ukonjugert 2b1 med 68% hemming. Det var ingen signifikant hemming MELLOM 2B1 med mAbs 5G5 OG 3G1 (27 og 30%). Mer fullstendig hemming ble oppnådd fra heterologe MABS 3G1 OG 5G5, FOR bindingen AV HRP-3G1 til antigen ble hemmet AV 5G5 med 61% hemming, HRP-konjugert 5G5 til antigen ble hemmet AV 3G1 med 99% hemming. Binding AV HRP-3G1 OG HRP-5G5 til p166w01-antigen ble også nesten fullstendig hemmet av seg selv (81 og 80% hemming). Disse resultatene tyder PÅ AT 3G1 OG 5G5 kan dele samme epitop eller overlappende epitop, men 2B1 gjenkjenner sannsynligvis et annet epitop.

Hemming av Binding av mAbs til p166Chn

resultatene av hemming er vist I Tabell 5: bindingen AV HRP-4C5 til p166Chn ble hemmet av ukonjugert 4C5 med 69% hemming, det var ingen signifikant hemming (25 og 30%) oppnådd fra de andre 2 ukonjugerte mAbs 3G1 og 4C5. En høyere hemmingshastighet ble imidlertid oppnådd fra HRP-konjugert mAbs 3g1 OG 5G5-binding til antigen, hemmet av ukonjugert 5g5 OG 3g1 med 65 og 76% hemming. Binding AV HRP-konjugert 3G1 og HRP-konjugert 5G5 til p166Chn-antigen ble også nesten hemmet av seg selv. Disse resultatene tyder også PÅ AT 3G1 OG 5G5 kan dele samme epitop eller overlappende epitop, MENS 4C5 sannsynligvis gjenkjenner et annet epitop.

Diskusjon

siden romanen svinehev først ble isolert , har anti-HEV-antistoffer blitt rapportert hos mange dyr, avslørt HEV-infeksjon blant dyr og mennesker, og dette kan overføres fra dyr til mennesker . Reduksjon av hepatitt e morbiditet og mortalitet var avhengig av vaksineforebygging og effektiv diagnose. Kunnskap om epitoper AV HEV var avgjørende for vaksinepreparering og diagnostisk utvikling . Påvisning av spesifikke antistoffer i serum er en av de viktigste diagnostiske metodene, og det er et økende antall serologiske analyser for antistoffdeteksjon. Imidlertid varierer analysene som brukes til å oppdage spesifikke antistoffer betydelig i følsomhet . Noen kommersielle diagnostiske analyser basert på genotype 1-eller 2-antigener påviser ikke serumantistoffer mot genotyper 3-eller 4-isolater . Lite er kjent om mekanismene bak noncorrespondence av de ulike diagnostiske analyser.

for tiden er et in vitro cellekultursystem fortsatt utilgjengelig for HEV-forskning. Derfor har pORF2 som inneholder de fleste immunogene steder blitt mye brukt til hev-immunologiske studier, med konformasjonsavhengig karakter . Det strukturelle grunnlaget for et immunogen for å fremkalle nøytraliserende og beskyttende antistoffer er den nøytraliserende epitopen, som er hovedmålet for hepatitt e-vaksineutvikling . Vi har tidligere rapportert at p166-proteinet, et avkortet protein av pORF2, kan modellere hev-nøytraliserende epitop(er), og antistoffer hevet mot p166 kunne kryss-nøytralisere forskjellige genotyper AV HEV . I tillegg var hepatitt e p239-vaksine avledet fra genotype 1 HEV effektiv i en fase 3 klinisk studie utført I Jiangsu-Provinsen, Kina, hvor epidemien HEV-isolat er genotype 4 . Disse funnene viste at felles nøytraliserende epitop (er) eksisterer innenfor DE forskjellige genotypene AV HEV. I tillegg til felles nøytraliserende epitop(er), har genotype-spe-cific epitop(er) også blitt bekreftet å eksistere, for mab forberedelse og karakterisering .

for ytterligere å identifisere karakteriseringen av felles og genotypespesifikke nøytraliserende epitoper, ble competitive inhibition assay etablert med felles nøytraliserende mabs, 3G1 OG 5G5, og genotypespesifikke nøytraliserende mAbs, 2B1 OG 4C5, for å undersøke konkurransebindingen til p166w01 eller p166Chn-antigen og for å avgjøre om mAbs gjenkjenner uavhengige, lignende eller overlappende epitoper.

i Utgangspunktet ble ascitic væsker av mAbs 3G1, 2B1, 5G5 OG 4C5 produsert, renset og konjugert MED HRP. ELISA-metoden ble brukt for å sammenligne bindingen af-finitet AV HRP-konjugerte mAbs med forskjellige genotyper AV HEV p166. Resultatene viste AT HRP-conjugat ed 2b1 bare reagerte med genotype 1 p166W01, men ikke p166Chn. PÅ samme måte reagerte HRP-konjugert 4C5 bare med p166Chn. I kontrast reagerte HRP-konjugerte 3g1 og 5G5 godt mot 2-genotypen p166-proteinene. Så konkurransedyktige bindende analyser er basert på genotypen 1 og 4 HEV p166 antigener. Resultatene av konkurransedyktige bindende analyser er ikke overraskende, dvs. at bindingen AV 2B1 til p166W01 bare konkurrerte av seg selv, mens 3G1 OG 5G5 kunne konkurrere om bindingen til p166W01. Videre ble bindingen AV 4C5 til p166Chn bare konkurrert av seg selv, MEN 3G1 OG 5G5 kunne konkurrere om bindingen til p166Chn. Disse funnene indikerte AT 3G1 OG 5G5 gjenkjenner de samme eller overlappende epitoper, og at 2b1 og 4C5 gjenkjenner forskjellige.

Dette er den første studien som undersøker de forskjellige egenskapene til genotype-felles og genotype-spesifikke konformasjonsnøytraliserende epitoper AV HEV. Vi viste at felles og genotype-spesifikke nøytraliserende epitoper kan være uavhengige. Denne oppdagelsen er svært gunstig for å demonstrere mekanismene som ligger til grunn for den lave konkordansen av de forskjellige diagnostiske analysene. Videre studier er av avgjørende betydning for å belyse de forskjellige egenskapene ved nøytraliserende epitoper AV HEV i effektiviteten av diagnostisk utvikling og vaksinepreparering.

Bekreftelse

dette arbeidet ble støttet av doctoral scientific research foundation Of Anhui Medical University (No. 0110037101).

Avsløringserklæring

forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Forfatter Kontakter

Artikkel – / Publikasjonsdetaljer

Copyright / Drug Dosering / Ansvarsfraskrivelse

Copyright: alle rettigheter reservert. Ingen deler av denne publikasjonen kan oversettes til andre språk, reproduseres eller benyttes i noen form eller på noen måte, elektronisk eller mekanisk, inkludert fotokopiering, opptak, mikrokopiering eller ved informasjonslagrings-og gjenfinningssystem, uten skriftlig tillatelse fra utgiveren.
Dosering av Legemidler: forfatterne og utgiveren har gjort sitt ytterste for å sikre at valg og dosering av legemidler som er angitt i denne teksten, er i samsvar med gjeldende anbefalinger og praksis ved publiseringstidspunktet. Men i lys av pågående forskning, endringer i offentlige forskrifter og den konstante strømmen av informasjon knyttet til medisinering og narkotikareaksjoner, blir leseren oppfordret til å sjekke pakningsvedlegget for hvert legemiddel for eventuelle endringer i indikasjoner og dosering og for ekstra advarsler og forholdsregler. Dette er spesielt viktig når det anbefalte stoffet er et nytt og / eller sjeldent ansatt stoff.
Ansvarsfraskrivelse: uttalelsene, meningene og dataene i denne publikasjonen er utelukkende de av de enkelte forfattere og bidragsytere og ikke av utgivere og redaktører. Utseendet på annonser eller / og produktreferanser i publikasjonen er ikke en garanti, godkjenning eller godkjenning av produktene eller tjenestene som annonseres eller deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhet. Utgiveren og redaktøren(e) fraskriver seg ansvar for eventuelle skader på personer eller eiendom som følge av ideer, metoder, instruksjoner eller produkter som er nevnt i innholdet eller annonsene.