Hva Er Southern Blotting?

Av Hannah Simmons, M. Sc.Anmeldt Av Kate Anderton, B.Sc. (Redaktør)

Blotting er prosessen DER DNA, RNA eller proteiner overføres til en membran for å bli visualisert.

Kreditt: Paul Cowan/. com

Den første av disse metodene var Southern Blotting, utviklet I 1975 Av Edward Southern, og brukes til å oppdage sekvensen AV DNA-fragmenter. Siden da har to andre metoder blitt utviklet, Kalt Nordlig og Vestlig blotting. Dette er prosesser som brukes til å identifisere HENHOLDSVIS rna og proteinsekvenser.

Metodikk For Southern blotting

DNA-fragmenter genereres først med restriksjonsenzymer og separeres etter størrelse i en prosess som kalles gelelektroforese. Alkalisk brukes da til å denaturere det dobbeltstrengede DNA, som danner enkeltstrenger. DNA overføres deretter til et nitrocellulose-eller nylonark ved å plassere en membran over gelen og bruke bufferstrømmen for å oppmuntre BEVEGELSEN AV DNA fra gelen til membranen.

Kapillærstrøm og vakuumoverføring er de to vanligste metodene som brukes til å overføre DNA-fragmentene. I kapillærstrøm plasseres gelen over buffernivået på en støtteblokk med en membran plassert på toppen. En stabel med absorberende håndklær plasseres deretter over membranen og brukes til å absorbere bufferen fra under gelen, og løfter DNA-fragmentene opp på membranen.

ved hjelp av vakuumoverføring plasseres membranen under gelen og begge er nedsenket i buffer. Et vakuum brukes deretter til å lage en strøm som trekker DNA-fragmentene ned på membranen.

Oppvarming eller UV-stråling brukes deretter for å sikre AT DNA-fragmentene forblir festet til membranen permanent, samtidig som DET spesifikke arrangementet AV DNA opprettholdes. Enkeltstrengede merkede prober brukes deretter til å binde seg til målsekvenser.

arket inkuberes med disse sondene og bare de komplementære sondene binder. De ikke-komplementære prober vaskes deretter fra membranen, slik at bare de bundne prober forblir. Disse sondene kan da oppdages ved autoradiografi for å avsløre mønsteret av hybridisering på en røntgenfilm.

Applikasjoner Av Southern blotting

Southern blotting har mange forskjellige bruksområder. For det første kan genrearrangementer analyseres. For eksempel, i immunologi kan denne metoden brukes til å identifisere klonale omarrangementer Av t-cellereseptor-gener. For det andre kan spesifikke fragmenter AV DNA identifiseres fra en blanding av mange andre fragmenter.

Andre eksempler på bruk inkluderer både begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) og variabel tall tandem gjenta (VNTR) analyse. RFLP bruker forskjeller i lengde i homologe DNA-sekvenser for å kartlegge genomer, og kan brukes i rettsmedisinske og farskapstester.

vntr analyse bruker forskjellene i lengden av gjentatte nukleotidsekvenser for å danne ET DNA-fingeravtrykk, en metode som ofte brukes i farskap og rettsmedisinske testing.

disse metodene kan også brukes i diagnostisering av sykdom forårsaket av mutasjon, for eksempel sigdcelleanemi. Denne genetiske tilstanden skyldes en enkelt nukleotidpolymorfisme (A Til T) i beta-globin-genet, noe som resulterer i unormalt hemoglobin.

Southern blotting For Fragile X syndrome

Southern blots har blitt brukt mye for å identifisere gener med forsterkede repeterende regioner. Dette er korte, repeterende sekvenser I DNA som ikke koder for genprodukter. Et eksempel hvor southern blotting kan være nyttig er i diagnosen Fragile X syndrom. Denne genetiske tilstanden skyldes økningen I CGG / CCG gjenta regionen som ligger innenfor fmr1 genet.

dette genet inneholder vanligvis mellom 5-40 repeterende regioner. Personer med 55-200 repetisjoner har en fmr1 gen premutasjon, og personer med > 200 repetisjoner har fragilt x syndrom. Økningen i gjentakelser fører til metylering av genet, som hemmer transkripsjon og forhindrer produksjonen AV fmrp-proteinet. Dette proteinet er nødvendig for normal funksjon av nervesystemet, derfor fører tap av proteinfunksjon til symptomene på fragile X syndrom.

ved diagnose brukes Metyleringsfølsomme restriksjonsenzym EclX1 og Metylerings-ufølsomme enzym EcoR1 for å tillate differensiering av metylerte alleler og ikke-metylerte alleler. Metylerte alleler kuttes bare en gang for å gi et enkelt DNA-fragment på 5,1 kb.

men ikke-metylerte alleler blir kuttet to ganger, og produserer et fragment på 2,8 kb. Ikke-metylerte premutasjonsrepetisjoner (<200) kan derfor skilles fra metylerte mutasjonsrepetisjoner på rundt 200 repetisjoner lenge, da southern blotting kan brukes til å identifisere STØRRELSEN PÅ DNA-fragmentene.

Framtidsperspektiver

Samlet Sett Er Southern blotting en viktig metode i diagnostisering og studier av sykdom (som fragilt X-syndrom og sigdcelleanemi) og analyse AV DNA av andre grunner(som rettsmedisinske og farskapstesting).

southern blotting er imidlertid veldig teknisk komplisert, dyrt, arbeidskrevende og krever en stor MENGDE DNA-prøve. Nye metoder erstatter derfor sakte sørlige blotting, for eksempel sanntid PCR. Denne prosessen er mye enklere og raskere enn southern blotting og krever bare et svært lite VOLUM DNA.

Videre Lesing

• Alt Genetikkinnhold
• Hva er Genetikk?
• Genetikkhistorie
• Genetikk Og Genuttrykk
• Genetisk Endring

Skrevet av

Hannah Simmons

Hannah er en medisinsk og biovitenskap forfatter Med En Master Of Science (M.Sc.) grad Fra Lancaster University, STORBRITANNIA. Før Han ble forfatter, fokuserte Hannahs forskning på oppdagelsen av biomarkører for Alzheimers og Parkinsons sykdom. Hun jobbet også for å belyse de biologiske veiene som er involvert i disse sykdommene. Utenom jobben liker Hannah å svømme, ta med hunden på tur og reise verden rundt.

Sitater