Protein rensing
Valg av utgangsmateriale er nøkkelen til utformingen av en renseprosess. I en plante eller et dyr er et bestemt protein vanligvis ikke fordelt homogent gjennom hele kroppen; forskjellige organer eller vev har høyere eller lavere konsentrasjoner av proteinet. Bruk av bare vev eller organer med høyest konsentrasjon reduserer volumene som trengs for å produsere en gitt mengde renset protein. Hvis proteinet er tilstede i lav overflod, eller hvis det har en høy verdi, kan forskere bruke rekombinant DNA-teknologi for å utvikle celler som vil produsere store mengder av det ønskede proteinet (dette er kjent som et uttrykkssystem). Rekombinant uttrykk gjør det mulig for proteinet å bli merket, f.eks. Ved En His-tag eller Strep-tag for å lette rensingen, og redusere antall rensetrinn som kreves.
en analytisk rensing benytter vanligvis tre egenskaper for å skille proteiner. For det første kan proteiner renses i henhold til deres isoelektriske punkter ved å kjøre dem gjennom en ph-gradert gel eller en ionbytterkolonne. For det andre kan proteiner separeres i henhold til deres størrelse eller molekylvekt via størrelsesekskluderingskromatografi eller ved sds-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese) analyse. Proteiner blir ofte renset VED HJELP AV 2D-SIDE og analyseres deretter ved peptid masse fingerprinting for å etablere protein identitet. Dette er veldig nyttig for vitenskapelige formål, og deteksjonsgrensene for protein er i dag svært lave og nanogrammengder protein er tilstrekkelig for analysen. For det tredje kan proteiner separeres ved polaritet / hydrofobicitet via væskekromatografi med høy ytelse eller omvendt fasekromatografi.
vanligvis inneholder en proteinrensingsprotokoll ett eller flere kromatografiske trinn. Den grunnleggende prosedyren i kromatografi er å strømme oppløsningen som inneholder proteinet gjennom en kolonne fullpakket med forskjellige materialer. Ulike proteiner interagerer forskjellig med kolonnematerialet, og kan dermed separeres av tiden som kreves for å passere kolonnen, eller betingelsene som kreves for å eluere proteinet fra kolonnen. Vanligvis oppdages proteiner når de kommer av kolonnen ved deres absorpsjon ved 280 nm. Det finnes mange forskjellige kromatografiske metoder:
Eksklusjonskromatografirediger
Kromatografi kan brukes til å separere protein i oppløsning eller denatureringsbetingelser ved bruk av porøse geler. Denne teknikken er kjent som størrelse eksklusjon kromatografi. Prinsippet er at mindre molekyler må krysse et større volum i en porøs matrise. Følgelig vil proteiner av et bestemt område i størrelse kreve et variabelt volum eluent (løsemiddel) før de samles i den andre enden av gelkolonnen.
i sammenheng med proteinrensing blir eluenten vanligvis samlet i forskjellige reagensrør. Alle reagensrør som ikke inneholder målbare spor av proteinet for å rense, kasseres. Den gjenværende løsningen er således laget av proteinet for å rense og andre tilsvarende proteiner.
Separasjon basert på ladning eller hydrofobitetrediger
Hydrofob interaksjon kromatografirediger
HIC-medier er amfifile, med både hydrofobe og hydrofile regioner, noe som gjør det mulig å separere proteiner basert på deres overflatehydrofobisitet. Målproteiner og deres produktaggregatarter har en tendens til å ha forskjellige hydrofobe egenskaper og fjerne dem via HIC renser proteinet av interesse ytterligere. I tillegg bruker miljøet vanligvis mindre harde denatureringsforhold enn andre kromatografiteknikker, og bidrar dermed til å bevare proteinet av interesse i sin opprinnelige og funksjonelle tilstand. I rent vann vil samspillet mellom harpiksen og de hydrofobe områdene av protein være svært svakt, men denne interaksjonen forbedres ved å bruke en proteinprøve TIL HIC harpiks i høy ionisk styrkebuffer. Den ioniske styrken til bufferen reduseres deretter for å eluere proteiner i rekkefølge av avtagende hydrofobicitet.
ionebyttekromatografirediger
ionebyttekromatografi separerer forbindelser i henhold til naturen og graden av deres ioniske ladning. Kolonnen som skal brukes, er valgt i henhold til type og styrke av ladning. Anionbytterharpikser har en positiv ladning og brukes til å beholde og skille negativt ladede forbindelser (anioner), mens kationbytterharpikser har en negativ ladning og brukes til å skille positivt ladede molekyler (kationer).
før separasjonen begynner, pumpes en buffer gjennom kolonnen for å balansere de motsatte ladede ioner. Ved injeksjon av prøven vil løsningsmolekyler bytte ut med bufferioner som hver konkurrerer om bindingsstedene på harpiksen. Lengden på oppbevaring for hvert stoff avhenger av styrken av ladningen. De mest svakt ladede forbindelsene vil eluere først, etterfulgt av de med suksessivt sterkere ladninger. På grunn av arten av separasjonsmekanismen spiller pH, buffertype, bufferkonsentrasjon og temperatur alle viktige roller i å kontrollere separasjonen.
Ionbytterkromatografi er et meget kraftig verktøy for bruk i proteinrensing og brukes ofte i både analytiske og preparative separasjoner.
Fri flyt-elektroforeserrediger
Free-flow electrophoresis (FFE) er en bærerfri elektroforese teknikk som tillater preparativ protein separasjon i en laminær buffer strøm ved hjelp av et ortogonalt elektrisk felt. Ved å bruke en pH-gradient, som for eksempel kan induseres av amfolytter, tillater denne teknikken å skille proteinisoformer opp til en oppløsning på < 0,02 delta-pI.
Affinitetskromatografirediger
Affinitetskromatografi er en separasjonsteknikk basert på molekylær konformasjon, som ofte benytter applikasjonsspesifikke harpikser. Disse harpikser har ligander festet til deres overflater som er spesifikke for forbindelsene som skal skilles. Oftest fungerer disse ligandene på en måte som ligner på antistoff-antigen-interaksjoner. Denne» lås og nøkkel » – passformen mellom liganden og målforbindelsen gjør den svært spesifikk, og genererer ofte en enkelt topp, mens alt annet i prøven ikke er oppnådd.
Mange membranproteiner er glykoproteiner og kan renses ved lektinaffinitetskromatografi. Vaskemiddeloppløsede proteiner kan få lov til å binde seg til en kromatografiharpiks som har blitt modifisert for å ha et kovalent festet lektin. Proteiner som ikke binder seg til lektin vaskes bort og deretter spesifikt bundet glykoproteiner kan elueres ved å tilsette en høy konsentrasjon av et sukker som konkurrerer med de bundet glykoproteiner på lektin bindingsstedet. Noen lektiner har høy affinitetsbinding til oligosakkarider av glykoproteiner som er vanskelig å konkurrere med sukkerarter, og bundet glykoproteiner må frigjøres ved denaturering av lektinet.
Immunoaffinitetskromatografirediger
Immunoaffinitetskromatografi bruker den spesifikke bindingen av et antistoff-antigen for å selektivt rense målproteinet. Prosedyren innebærer å immobilisere et protein til et fast substrat (f.eks. en porøs perle eller en membran), som deretter selektivt binder målet, mens alt annet strømmer gjennom. Målproteinet kan elueres ved å endre pH eller saltholdigheten. Den immobiliserte liganden kan være et antistoff (Som Immunoglobulin G) eller det kan være et protein (Som Protein A). Fordi denne metoden ikke involverer engineering i en tag, kan den brukes til proteiner fra naturlige kilder.
Rensing av et merket proteinEdit
En Annen måte å merke proteiner på er å konstruere et antigenpeptidmerke på proteinet, og deretter rense proteinet på en kolonne eller ved å inkubere med en løs harpiks som er belagt med et immobilisert antistoff. Denne spesielle prosedyren er kjent som immunoprecipitation. Immunoprecipitation er ganske i stand til å generere en ekstremt spesifikk interaksjon som vanligvis resulterer i binding bare ønsket protein. De rensede merkede proteinene kan da lett separeres fra de andre proteinene i oppløsning og senere elueres tilbake til ren løsning.
når kodene ikke trengs lenger, kan de spaltes av en protease. Dette innebærer ofte å konstruere et proteasespaltingssted mellom taggen og proteinet.
HPLCEdit
væskekromatografi Med høy ytelse eller høytrykksvæskekromatografi er en form for kromatografi som bruker høyt trykk for å drive solutene raskere gjennom kolonnen. Dette betyr at diffusjonen er begrenset og oppløsningen er forbedret. Den vanligste formen er» reversert fase » HPLC, hvor kolonnematerialet er hydrofobt. Proteinene elueres av en gradient av økende mengder av et organisk løsningsmiddel, slik som acetonitril. Proteinene eluerer i henhold til deres hydrofobicitet. Etter rensing AV HPLC er proteinet i en løsning som bare inneholder flyktige forbindelser, og kan lett fryses. HPLC-rensing resulterer ofte i denaturering av de rensede proteinene og er derfor ikke anvendelig for proteiner som ikke spontant refoldes.