Proteinase K
Aktivert av kalsium, fordøyer enzymet proteiner fortrinnsvis etter hydrofobe aminosyrer(alifatiske, aromatiske og andre hydrofobe aminosyrer). Selv om kalsiumioner ikke påvirker enzymaktiviteten, bidrar de til stabiliteten.Proteiner vil bli fullstendig fordøyd dersom inkubasjonstiden er lang og proteasekonsentrasjonen høy nok. Ved fjerning av kalsiumioner reduseres enzymets stabilitet, men den proteolytiske aktiviteten forblir. Proteinase K har To bindingssteder For Ca2+, som ligger nær det aktive senteret, men er ikke direkte involvert i den katalytiske mekanismen. Restaktiviteten er tilstrekkelig til å fordøye proteiner, som vanligvis forurenser nukleinsyrepreparater. Derfor utføres fordøyelsen Med Proteinase K for rensing av nukleinsyrer vanligvis i nærvær AV EDTA (inhibering av metallionavhengige enzymer som nukleaser).
Proteinase K er også stabil over et bredt pH-område (4-12), med en ph optimal pH 8,0.En økning i reaksjonstemperaturen fra 37 °C til 50-60 hryvnias C kan øke aktiviteten flere ganger, som tilsetning av 0,5–1% natriumdodecylsulfat (SDS) Eller Guanidiniumklorid (3 M), Guanidiniumtiocyanat (1 M) og urea (4 M). Ovennevnte forhold øker proteinase K-aktiviteten ved å gjøre substratspaltningsstedene mer tilgjengelige. Temperaturer over 65 °C, trikloreddiksyre (TCA) eller serinproteasehemmerne AEBSF, PMSF eller DFP hemmer aktiviteten. Proteinase K vil ikke hemmes Av Guanidiniumklorid, Guanidiniumtiocyanat, urea, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrat, jodeddiksyre, EDTA eller av andre serinproteasehemmere Som Na-Tosyl-Lys Klormetylketon (TLCK) og Na-Tosyl-Phe Klormetylketon (Tpck).
Protease K-aktivitet i vanlige buffere
| Buffer (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 µ/mL protease K,15 min inkubasjon) | Proteinase K-aktivitet (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris * Cl; 36 MM EDTA; 5% Tween 20; 0,36% Triton X-100; 735 Mm GuHCl | 301 |
| 10 Mm Tris * Cl; 25 MM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 MM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris * Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% Tween 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 Mm Tris * Cl; 100 MM EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 MM EDTA; 1% SDS | 203 |