Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) og katekoloksidase (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, som tilhører en proteinfamilie som har det katalytiske senteret dannet av dinukleær type-3 kobber, katalyserer ortohydroksyleringen av monofenol og den etterfølgende oksidasjon Av Det Difenoliske Produktet Til Det Resulterende Kinonet.178 en serie reaksjoner oppstår under samtidig reduksjon av molekylært oksygen til vann. Kinonproduktet er en reaktiv forløper for syntese av melaninpigmenter. Tyrosinase, som finnes i grønnsaker, frukt og sopp, er et nøkkelenzym i bruningen som oppstår ved blåmerker eller langtidslagring. I pattedyr er enzymet ansvarlig for hudpigmenteringsavvik, som flekker og defekter.179 tyrosinase er således ganske betydelig innen landbruk og industri. I kosmetisk industri er utvikling og screening av potente inhibitorer av tyrosinase spesielt attraktive.
Tyrosinase er klassifisert i type-3 kobberproteinfamilien, som katekoloksidase og respiratorisk pigmenthemocyanin. Under den katalytiske reaksjonen finnes type-3 kobbersenter av tyrosinase i tre redoksformer.178 deoksyformen(Cu(I)–Cu (I)) er en redusert art, som binder oksygen for å gi oksyformen(Cu(II)–O22–Cu (II)). I oksyformen er molekylært oksygen bundet som peroksid i en μ-η2: η2 side-på-bro-modus, som destabiliserer O – o-bindingen og aktiverer den. Met-formen(Cu(II)–Cu (II)) antas som en hvilende enzymatisk form, hvor Cu(II) ioner normalt er bro til en liten ligand, for eksempel et vannmolekyl eller hydroksydion.
Katekoloksidase oksiderer ortodifenoler til de tilsvarende kinonene, men mangler monooksygenase-eller kresolaseaktivitet. Hemocyanin fungerer som oksygenbærer i leddyr og bløtdyr.
krystallstrukturer av tyrosinase Fra Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 og katekoloksidase Fra søtpotet Ipomoea batatas180 er blitt bestemt. De bekrefter at koordinasjonen av type-3 kobberstedet i tyrosinase og katekoloksidase er svært lik den som finnes i hemocyanin. Dette hadde blitt utledet før fra likheten av spektroskopiske egenskaper og en sammenligning av mange tyrosinase og hemocyanin primære strukturer.181-183 på grunnlag av den biologiske kilden til proteinene kunne syv forskjellige domeneorganisasjoner identifiseres. Plantekatekoloksidaser av forskjellige organismer har en sekvensidentitet på ca 40-60%. Sekvensidentiteten mellom katekoloksidaser og mulluscan hemocyaniner er omtrent 35% over nesten hele lengden av sekvensene. I kontrast er sekvensidentiteten mellom plantekatekoloksidaser og andre type-3 kobberproteiner fra en hvilken som helst ikke-plantekilde begrenset til de to kobberbindende områdene.
de to kobberbindende områdene viser høyest bevaring gjennom alle type-3 kobberproteiner. Spesielt regionen bindende CuB er svært konservert, Mens CuA-bindende regionen viser mer sekvens variasjon og har blitt holdt ansvarlig for de ulike funksjonene til tyrosinase, katekoloksidase, og hemocyanin.
den samlede strukturen av tyrosinase Fra S. castaneoglobisporus i kompleks med åpen leseramme ELLERF378 vises I Figur 23. Tyrosinase tar α-spiralformede strukturer med kjernen av enzymet, som dannes av en fire-helix-bunt. Det katalytiske dinukleære kobbersenteret sitter fast i spiralformet bunt (Figur 23). Hver av de to kobberioner i et aktivt område er koordinert av Tre His rester (Figur 24), som er avledet fra de fire helikser av den α-bundle unntatt His54. En kobberion (betegnet CuA) er koordinert Av His38, His54 Og His63. His38 og His63 ligger midt i henholdsvis α2 og α3. Den andre kobberionen (CuB) er koordinert Av His190, His194 Og His216. Resterne His190 og His194 er henholdsvis i begynnelsen og midt i α6, og His216 er midt i α7. Dette dicopper-senteret ligger i bunnen av den store konkaviteten som en antatt substratbindende lomme, som dannes av de hydrofobe rester. I tillegg til den spiralformede strukturen har tyrosinase noen få β-strukturer, som dømt fra ryggradens torsjonsvinkler. I disse danner bare N – og C-terminale β-tråder en arkstruktur.
Figur 23. Bånddiagram over tyrosinase Fra Streptomyces castaneoglobisporus i kompleks MED ORF378 (PDB-kode: 1WX3). Tyrosinase OG ORF378 er vist i henholdsvis rosa og bringebær. Kobberionene CuA og CuB er avbildet som gule kuler; forberedt med PyMOL (Wl DeLano, Palo Alto, 2003).
Figur 24. Met-formen av det aktive sentrum av tyrosinase Fra Streptomyces castaneoglobisporus(PDB-kode: 1WX3); forberedt Med PyMOL(Wl DeLano, Palo Alto, 2003).
selv om aminosyresekvensen av tyrosinase bare har 25,3 og 26, 0% identiteter med De Av i. batatas catechol oxidase180 og odg-domenet Til Blekksprut dofleini hemocyanin, henholdsvis 184, er den generelle strukturen ganske lik deres. Blant disse tre proteinene er det observert en høy grad av bevaring i kjernedomenet som består av α-bunten. Tyrosinase og hemocyaniner Fra Panulirus interruputus185 Og L. polyphemus66 viser ingen signifikant homologi og ingen likhet i deres strukturer, men de katalytiske kjernedomenene til disse proteinene er overlegne.
for tyrosinase Fra s. castaneoglobisporus fem forskjellige tilstander av det aktive stedet kan karakteriseres i krystallstrukturer, nemlig kobberfri form, met form I, met FORM II, deoksy OG oxy. I krystallstrukturer av katekoloksidase fra i. batatas har met-og deoksystatene samt et inhibitorkompleks blitt belyst. I met-tilstanden(Cu(II), Cu (II)) er de to cupric-ionene i en avstand på 2.9 Å, hver av dem koordinert av tre histidiner. De er brodd av et annet atom, mest sannsynlig en hydroksidion, i en avstand på ca 1,8 Å fra hver cupric ion, slik at hver av dem har et koordinasjonsnummer på 4 (Se Figur 24, som viser samme situasjon for tyrosinase Fra s. castaneoglobisporus). I deoksy eller redusert tilstand er begge kobberatomer i + 1 oksidasjonstilstand. Kobber-kobber-avstanden er 4.4 Å Koordinasjonsnumrene er 4 For CuA (tre histidin-ligander og et koordinerende vannmolekyl) og 3 for CuB (tre histidin-ligander). Koordinasjonssfæren er forvrengt trigonal pyramidal for CuA og firkantet plan for CuB(koordinasjonsstedet okkupert AV broen OH-i met-tilstanden er ledig). I inhibitorkomplekset med fenyltiourea (PTU) øker kobber–kobberavstanden til 4,2 Å med svovelatomet AV PTU som erstatter hydroksobroen i met-tilstanden. Koordineringsfeltene til de to coppers forblir lik de i met-staten, men det er konformasjonsendringer på de aktive stedrester. Den viktigste endringen er en rotasjon av den aromatiske ringen Av Phe261 (katekoloksidasenummerering).
sammenlignet med met-tilstanden har koordineringsrester bare litt forskjellige posisjoner i redusert tilstand, noe som indikerer en ganske stiv lomme. Endringene i koordinasjonen er knyttet til bevegelser av kobberatomer i lommen. Inhibitorkomplekset viser At Phe261 ligger over det aktive stedet som en port, som roterer etter at inhibitoren er bundet. Dermed synes tilgangen av substratet til det katalytiske metallsenteret å bli styrt av denne portresten.
den katalytiske mekanismen for tyrosinase ble først studert i detalj Av Solomon et al.178 Solomon foreslått en mekanisme for både kresolase og katekolase aktiviteter av tyrosinase (Figur 25). Denne mekanismen antyder at oksy-tilstanden er utgangspunktet for kresolaseaktivitet (indre sirkel). Denne tilstanden er tilstede i hvileformen av tyrosinase i en andel på ca 15% (85% met tilstand). Et monofenolsubstrat binder seg til oksystaten og monooksygeneres til o-difenol. Denne difenol binder seg deretter til kobbersenteret av mettyrosinase i en bidentatbindingsmodus foreslått på grunnlag av en modellforbindelse.188 Oksidasjon av difenolsubstratet fører til redusert tilstand av dinuclear kobber senter. Reoksidering av redusert tilstand til oksy-tilstanden skjer ved angrep av dioksygen og lukker katalytisk syklus.
Figur 25. Mekanisme for kresolase og katekolaseaktivitet av tyrosinase og katekoloksidase utviklet på grunnlag av Et innledende forslag Fra Solomon og coworkers178 og med nyere resultater.186,187 Gjengitt Fra C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, med tillatelse Fra American Chemical Society.
mekanismen for katekolaseaktivitet (ytre sirkel) starter fra oksy-og met-tilstandene. Et difenolsubstrat binder seg til met-tilstanden (for eksempel), etterfulgt av oksidasjon av substratet til den første kinonen og dannelsen av enzymets reduserte tilstand. Binding av dioksygen fører til oksystaten, som senere angripes av det andre difenolmolekylet. Oksidasjon til den andre kinonen danner met-tilstanden igjen og lukker katalytisk syklus.
Alternative reaksjonsmekanismer inkluderer en radikal mekanisme foreslått Av Kitajima Og Morooka189 og en mekanisme som involverer Et Cu (III) mellomprodukt basert på målinger av modellforbindelser.190 på grunnlag av krystallstrukturen av katekoloksidase-PTU-inhibitorkomplekset ble monodentatbinding av substratet foreslått for katekoloksidase.180 en radikal mekanisme, som foreslått for den svake katekolaseaktiviteten som finnes i Blekksprut vulgaris hemocyanin, er 191 også mulig for katekoloksidase på grunn av det sterke strukturelle forholdet mellom katekoloksidase fra i. batatas og odg hemocyanin som beskrevet ovenfor.
den distinkte forskjellen mellom katekoloksidase og tyrosinase er ennå ikke forklart. En lagfase i tyrosinasens monofenolaseaktivitet har blitt funnet og studert og foreslås å være et resultat av midlertidig inhibering av met-tilstanden av tyrosinase ved overskudd av monofenolsubstratet (Figur 25).186 Monofenolaseaktivitet øker når difenolproduktet forskyver monofenolen fra mettyrosinase og tillater videreføring av katalytisk syklus. Katekoloksidase i sin isolerte form er tilstede utelukkende i met-tilstanden og hemmer også av fenol. Det ble derfor foreslått at mangel på oxy-tilstanden er årsaken til at katekoloksidase mangler kresolaseaktivitet. Siden oksykatekoloksidase også viser ingen monooksygenaseaktivitet, virker denne forklaringen ikke helt tilfredsstillende. En annen mulig årsak er at tilgang Til CuA,som har blitt foreslått å være nødvendig for oksygenering av monofenoler, 192 er blokkert i krystallstrukturen av katekoloksidase fra i. batatas.