4G / 4G-Genotype van het Pai-1-Gen gaat gepaard met een verminderd risico op beroerte bij ouderen

plasminogeenactivator-remmer type 1 (PAI-1), dat een complex vormt met Weefsel-type plasminogeenactivator (tPA), is een sterke remmer van fibrinolyse.1 Hoge Pai-1 activiteit is in verband gebracht met een verhoogd risico op coronaire voorvallen bij populaties met angina pectoris2,3 en bij post–myocardinfarct (MI) patiënten.4,5 echter, PAI-1 is waarschijnlijk geen onafhankelijke risicofactor voor coronaire hartziekten in het algemeen (gezonde) populaties.6-9

het 4G / 5G-polymorfisme is een veel voorkomend polymorfisme in het promotorgebied van het Pai-1-gen.10 zowel de 4G als de 5G allelen hebben een bindingsplaats voor een activator van transcriptie. Het 5G-allel heeft echter een extra bindingsplaats voor een onderdrukker, wat resulteert in lagere transcriptiepercentages en minder PAI-1-activiteit.11-13 een associatie tussen het 4G/5G polymorfisme en hart-en vaatziekten (CVD) zou een causale rol van PAI-1 ondersteunen, aangezien het niet waarschijnlijk is dat het genetisch bepaalde niveau wordt beïnvloed door het (inflammatoire) ziekteproces en cardiovasculaire risicofactoren. Een recente meta-analyse van 9 studies toonde een 20% verhoogd risico op MI voor het 4G/4G genotype.14

de associaties van PAI-1 en het 4G / 5G polymorfisme met beroerte kregen weinig aandacht in vergelijking met de relatie met coronaire hartziekten. In de Noord-Zweedse Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease (MONICA) studie werd het risico van een eerste beroerte voorspeld door het TPA*PAI-1 complex, maar niet door PAI-1 activiteit.Epidemiologische gegevens wijzen op een beschermend effect van het 4G-allel tegen cerebrovasculaire voorvallen.16-21 in de huidige populatie-gebaseerde studie bij 637 Nederlandse ouderen onderzochten we de afzonderlijke en gecombineerde effecten van PAI-1 Activiteit en het 4G/5G polymorfisme op de incidentie van cardiovasculaire voorvallen.

onderwerpen en methoden

studiepopulatie

de Arnhemse ouderen studie is een populatie-gebaseerde cohort studie die begon in 1991/1992. We nodigden een steekproef uit (gestratificeerd naar leeftijd en geslacht) van 1793 zelfstandig levende mannen en vrouwen van 65 tot 84 jaar in Arnhem, Nederland. In totaal stemden 1012 proefpersonen in met een interview en 685 stemden in met een lichamelijk onderzoek en een vlindernaald (=aderpunctie). De opzet van het onderzoek en de karakteristieken van de populatie zijn elders in detail beschreven.22

bij 641 proefpersonen werd een enkel bloedmonster verkregen dat niet vastzat. Gegevens over zowel de Pai-1-activiteit als het 4G/5G-polymorfisme ontbraken voor 4 proefpersonen, zodat er 637 proefpersonen overblijven voor de huidige analyse. De Pai-1-activiteit kon niet worden beoordeeld bij 31 proefpersonen en genotypering was niet succesvol bij 8 proefpersonen. De populatie voor deze studie omvatte meer mannen dan de populatie die niet deelnam of alleen een interview had (52% versus 44%; P=0,01) en significant jonger was (73,6 versus 76,1 jaar; p<0,001). Andere kenmerken, waaronder leefstijlfactoren en zelfgewaardeerde gezondheid, verschilden niet significant tussen deze groepen. Alle vakken hadden schriftelijke geïnformeerde toestemming en de studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Wageningen Universiteit.

gegevensverzameling

opgeleide interviewers verzamelden gegevens over levensstijl, huidige en vroegere gezondheid en medicatie. Roken status werd gecodeerd als huidige, Voormalige, of nooit. Body mass index (BMI) werd berekend als gewicht gedeeld door lengte in het kwadraat (kg/m2). CVD werd geacht aanwezig te zijn als proefpersonen een voorgeschiedenis van hartziekten of beroerte meldden. Personen werden geacht cardiovasculaire medicatie te gebruiken als zij gedurende de 3 maanden voorafgaand aan het interview angiotensine-converterend-enzymremmers, β-blokkers, trombolytische middelen, lipidenreducerende middelen en/of salicylaten hadden gebruikt. Hypertensie werd gedefinieerd als bloeddruk ≥160/95 mm Hg of gebruik van antihypertensiva.

laboratoriumbepalingen

Vlindernaald (=Aderpunctie) werden uitgevoerd tussen 8 uur en 5 uur.:30 pm met het gebruik van citraatverzamelingsbuizen, en het tijdstip van bloedbemonstering werd geregistreerd. De monsters werden bewaard bij -80°C. De Plasma-Pai-1-activiteit werd bepaald met de Chromolize-kit (Biopool). De variabele voor PAI-1 die in deze studie werd gebruikt, is het gedeelte van de totale PAI-1 dat overblijft na de vorming van het TPA*PAI-1 complex. tPA antigeen werd gemeten met de Imulyse kit (Biopool). De 4G / 5G genotypering werd uitgevoerd volgens Margaglione et al, 23 met lichte wijziging. Kort, werd een gemuteerd oligonucleotide samengesteld, die een plaats voor het enzym bseli binnen het product van versterking plaatste. Polymerasekettingreactieproducten werden bij 55°C verteerd met het bseli-enzym (MBI Fermentas). Totaal cholesterol in Serum werd enzymatisch bepaald (CHOD-PAP) en de HDL-en LDL-cholesterolspiegels werden direct gemeten (respectievelijk Dimensiehdl-methode en N-Genegeen LDL). Serum insuline werd bepaald met een immunometrische test (Immulite 2000 insuline). C-reactief eiwit (CRP) werd beoordeeld met een zeer gevoelige enzyme-linked immunosorbent assay procedure.24

Follow-Up

gemeentelijke registers leverden tot februari 2001 gegevens over mortaliteit en migratie op. Eén persoon ging door emigratie verloren voor de follow-up. Gegevens over morbiditeit en oorzaakspecifieke mortaliteit werden verkregen van huisartsen door middel van een standaardformulier. In Nederland vormt de huisarts de centrale schakel naar alle gespecialiseerde medische zorg, en klinische gebeurtenissen zullen waarschijnlijk niet gemist worden door onze follow-up procedure. Negenendertig proefpersonen gaven geen toestemming voor het verzamelen van vervolggegevens. Voor een aantal proefpersonen kon de huisarts niet worden getraceerd (n=31), werkte hij niet mee (n=39) of verschafte hij geen juiste gegevens (n=10). De Follow-up op morbiditeit en oorzaak-specifieke mortaliteit was compleet voor 518 patiënten (268 mannen en 250 vrouwen; 81% van de patiënten met gegevens over Pai-1 en/of 4G/5G genotype). De kenmerken van de proefpersonen die werden gevolgd waren vergelijkbaar met die welke niet werden gevolgd, met uitzondering van een lagere serumcholesterolspiegel (6,0 versus 6,3 mmol/L; P=0,02).Cardiovasculaire voorvallen en doodsoorzaken werden gecodeerd door een arts (E. J. G.) op basis van door de huisarts verkregen informatie, volgens de International Statistical Classification of Diseases, 10th Revision (ICD-10). De eindpunten omvatten mortaliteit ongeacht de oorzaak, cardiovasculaire mortaliteit (ICD-codes I00 tot I96), incidentie van MI (i21 tot I22, fataal en niet-fataal), incidentie van beroerte (I60 tot I69, fataal en niet-fataal) en incidentie van transient ischemic attack (tia) (G45). In het geval van terugkerende gebeurtenissen werd alleen de eerste gebeurtenis in de analyse overwogen.

statistische analyse

verschillen in kenmerken van de proefpersonen tussen de 4G/5G genotypes werden getest met ANOVA (continue variabelen) of χ2 testen (categorische variabelen). De aanwezigheid van Hardy-Weinberg evenwicht voor 4G/5G polymorfisme werd onderzocht door χ2 test. Spearman correlatiecoëfficiënten (rs) werden berekend voor de associatie van PAI-1 met andere cardiovasculaire risicofactoren. Hazard rate ratio ’s (later aangeduid als relatieve risico’ s ) in TERTIELEN van PAI-1 en tPA werden verkregen door Cox proportional hazard analysis, waarbij het laagste tertiel als referentie werd gebruikt. RR ‘ s werden aangepast voor leeftijd en geslacht (model 1) en bovendien voor BMI, rookstatus (huidige, voormalige, nooit), voorgeschiedenis van CVD, cardiovasculaire medicatie, hypertensie, totaal cholesterol, LDL-cholesterol en serum CRP (model 2). Analyses van PAI-1 en tPA werden bovendien aangepast voor de tijd van bloedbemonstering vanwege circadiaanse variatie. Het SAS-systeem werd gebruikt voor statistische analyses. Het significantieniveau werd vastgesteld op een 2-zijdige waarschijnlijkheidswaarde <0,05.

resultaten

het risico op cardiovasculaire voorvallen en mortaliteit door alle oorzaken bij tertielen van PAI-1-activiteit (<0,9; 0,9 tot 3,9 en >3,9 IE/mL) wordt weergegeven in Tabel 2. Een 3-voudig verhoogd risico op beroerte werd waargenomen in de middelste en hoogste tertielen van PAI-1, die sterker werden (RR >5) na aanpassing voor cardiovasculaire risicofactoren (voornamelijk BMI en serumlipiden). Uitsluiting van 129 proefpersonen met een voorgeschiedenis van CVD veranderde de relaties Niet (gegevens worden niet getoond). Aanvullende aanpassing voor tPA verzwakte enigszins de associatie van PAI-1 met cardiovasculaire mortaliteit (RR=2,0; 95% BI, 1,0 tot 3,9 in het midden tertiel, en RR=2,5; 95% BI, 1,1 tot 5,7 in het hoogste tertiel) en totale mortaliteit (RR=1,1; 95% BI, 0,8 tot 1,6, en RR=1,4; 95% BI, 0,9 tot 2,1, respectievelijk). PAI – 1-activiteit werd positief geassocieerd met incidentie van MI en TIA, maar de trend over tertielen bereikte geen statistische significantie (Tabel 2).

de associatie van het 4G/5G-genotype met cardiovasculaire voorvallen en mortaliteit ongeacht de oorzaak wordt weergegeven in Tabel 3. Na aanpassing voor leeftijd en geslacht was het risico op beroerte, TIA en cardiovasculaire mortaliteit verminderd met >50% bij proefpersonen met het 4G/4G-genotype. Aanpassing voor cardiovasculaire risicofactoren (model 2) veranderde deze associaties niet wezenlijk. Het beperken van de analyse tot ischemische beroerte leidde tot een sterker verlaagd risico voor het 4G/4G genotype (RR=0,2; 95% BI, 0,04 tot 1,0). Het 4G / 5G-polymorfisme voorspelde incidentele MI en mortaliteit door alle oorzaken niet significant (Tabel 3).

figuur 1 toont een overzicht van epidemiologische studies over 4G/5G polymorfisme en beroerte. Figuur 2 geeft het risico op beroerte weer in de categorieën Pai-1, 4G/5G-genotype in plasma, en deze factoren gecombineerd. De voorspelde 10-jaars beroerte-vrije overleving was sterk verminderd tot 72,2% bij 5G-dragers met verhoogde PAI-1 (≥0,9 IE/mL) vergeleken met 97,6% voor 4G-homozygoten met lage PAI-1 (<0,9 IE/mL). Cox proportionele hazard analyse gecorrigeerd voor leeftijd, geslacht en tijdstip van bloedbemonstering toonde vergelijkbare resultaten.

discussie

in een algemene populatie van Nederlandse ouderen vonden we een sterk verminderd risico op beroerte, TIA en cardiovasculaire mortaliteit voor het 4G/4G genotype van het Pai-1 gen. In tegenstelling tot deze bevinding werd een hoge Pai-1-activiteit in plasma geassocieerd met een verhoogd risico op cerebrovasculaire gebeurtenissen. Het risico op beroerte was opmerkelijk hoog in 5G-dragers met verhoogde plasma PAI-1.

onze onderzoekspopulatie was niet in het Hardy-Weinberg-evenwicht voor het 4G/5G-polymorfisme (4G/4G, 31%; 4G/5G, 46%; en 5G / 5G, 24%). Het genotype 5g / 5G lijkt oververtegenwoordigd in onze populatie in vergelijking met een andere Nederlandse studie onder >12 000 vrouwen (verdeling van respectievelijk 31%, 51% en 18%).20 de onevenwichtigheid in onze studie kan het gevolg zijn van selectie gerelateerd aan genotype, mogelijk als gevolg van uitsluiting van geïnstitutionaliseerde ouderen of differentiële overleving. Echter, de 4G / 5G genotype verdeling in onze studie was niet erg afwijkend van die van andere witte populaties. In het onderzoek naar insulineresistentie atherosclerose 25 was de verdeling in blanken 29% voor 4G/4G, 47% voor 4G/5G en 25% voor 5G/5G, wat werd gemeld in het Hardy-Weinberg-evenwicht. Bij 205 personen > 80 jaar waren de overeenkomstige verdelingen 30%, 47% en 23%.26 vanwege de prospectieve aard van onze analyses, denken we niet dat de afwezigheid van een Hardy-Weinberg evenwicht voor het 4G/5G polymorfisme heeft geresulteerd in een grote vervorming van onze bevindingen.

we melden een beschermend effect van het 4G-allel tegen beroerte, wat overeenkomt met eerdere epidemiologische studies.16-21 een Koreaanse studie leverde contrasterende gegevens op, mogelijk als gevolg van raciale verschillen.Met betrekking tot andere uitkomsten zagen we een bescheiden risicoverhoging voor incidentele MI bij 4G/4G-patiënten. Deze bevinding, hoewel niet statistisch significant,is in overeenstemming met de meta-analyse door Boekholdt et al, 14 die een totale odds ratio van 1,2 (95% BI, 1,0 tot 1,4) rapporteerden. We vonden een sterk verminderd risico op cardiovasculaire mortaliteit voor 4G/4G, waarschijnlijk als gevolg van cerebrovasculaire aandoeningen die 43% van de fatale gevallen vormden.

Plasma PAI-1 bleek in onze studie geen zeer sterke risicofactor voor MI te zijn (RR ≈1,5). Aanpassing voor de inflammatoire marker CRP of uitsluiting van prevalente CVD-gevallen had geen invloed op deze relatie. Onze gegevens zijn in overeenstemming met de cardiovasculaire gezondheid studie onder oudere proefpersonen,6 waarin PAI-1 was geen sterke voorspeller van coronaire gebeurtenissen. Een relatie tussen PAI-1 en incidenteel MI is voornamelijk gevonden bij patiënten met coronaire stoornissen,2-5 wat de relatief zwakke associatie bij een algemene populatie ouderen kan verklaren. Wij behoren tot de eersten die aantonen dat verhoogde plasma PAI-1 (voornamelijk onafhankelijk van 4G/5G) een sterke risico-indicator is voor beroerte op oudere leeftijd. Het onderliggende mechanisme van Pai-1 verhoging kan van genetische oorsprong zijn, maar de genetische regulatie van plasma PAI-1 is grotendeels onbekend. Als alternatief, Pai-1 verhoging kan worden veroorzaakt door een onderliggend mechanisme van insulineresistentie en systemische ontsteking, als onderdeel van het CVD-proces.1

onze gegevens suggereren dat de genotype-fenotype Associatie voor 4G/5G polymorfisme en PAI-1 zwak is. Differentiële Regulatie of functie van PAI-1 in plasma en weefsel kan de contrasterende bevindingen verklaren voor de 4G/5G polymorfisme en PAI-1 activiteit die we vonden in relatie tot beroerte. Bij dieren zijn lokale cellulaire productie van PAI-1 en tPA en een duidelijke rol van dit proteasesysteem in weefsels aangetoond.28,29 gelokaliseerde ontstekingsprocessen spelen een belangrijke rol in het proces van atherosclerose en plaquescheuring. Op basis van onze gegevens stellen we voor dat er lokale mechanismen in hersenweefsel zijn die verantwoordelijk zijn voor het beschermende effect van 4G/5G tegen een beroerte. We veronderstellen dat op ontstekingsplaatsen de vermeende toename van PAI-1 sterker is voor het 4G-allel en dat dit de proteolyse remt. Dit kan bijvoorbeeld resulteren in plaque stabilisatie en verhoogde neutralisatie van TPA, die potentieel neurotoxisch is.Tot slot wijzen onze gegevens op een beschermende rol voor het 4G-allel bij de ontwikkeling van een beroerte op oudere leeftijd, terwijl PAI-1-activiteit in plasma schadelijk lijkt te zijn. Deze schijnbaar paradoxale relatie moet worden bevestigd in grote populatie-gebaseerde studies die zich richten op zowel PAI-1 Activiteit en 4G/5G polymorfisme.

voetnoten