Celbiologie 06: het cytoskelet Deel II: tubuline

dit zijn aantekeningen uit lezing 6 van Harvard Extension ‘ s Cell Biology course.

vorige week hebben we microfilamenten behandeld, die gemaakt zijn van actine. Deze week: microtubules, gemaakt van tubuline. Waarom, vraag je je af, heeft het cytoskelet twee aparte systemen nodig? Bedenk dat microfilamenten slechts ketens van individuele subeenheden zijn, terwijl microtubuli letterlijk buizen zijn (zoals we binnenkort zullen zien) – holle cilinders met wanden gemaakt van kettingen gemaakt van dimeren. Deze verschillende structuren betekenen verschillende mogelijkheden: microfilamenten kunnen zich gemakkelijker spontaan vormen en kunnen (met behulp van Arp2/3 en andere laatst besproken complexen) vertakken om verschillende netwerkvormen te vormen en verschillende delen van de cel te verbinden. De Microtubules baseren zwaarder op nucleation om zich te vormen, en zijn fundamenteel een spaaknetwerk die centrosome met de periferie van de cel verbinden. In de praktijk, zijn microfilamenten overvloedig in de celschors en zwaar betrokken bij contractiele bewegingen en celmotiliteit, terwijl microtubules het meest betrokken zijn bij het organiseren van organellen en dienen als sporen voor anterograde en retrograde vervoer.

microtubuli

(afbeelding dankzij Wikimedia Commons-gebruiker Jeffrey81)

naast Wikipedia zijn eerdere edities van de studieboeken Lodish en Cooper cell biology die beschikbaar zijn op NCBI ook uitstekende referenties.

de buisstructuur van microtubuli is steviger dan microfilamenten, waardoor veel zware trekken en duwen mogelijk is. Hoewel stevig, microtubuli zijn temperatuur-afhankelijk – ze depolymeriseren als gekoeld tot 4°C en zal opnieuw te repolymeriseren als verwarmd tot 37°C op voorwaarde dat GTP beschikbaar is.

de basisbouwsteen van microtubuli is een α-tubuiline / β-tubulinedimer (gecodeerd door respectievelijk TUBA_GENEN en TUBB_GENEN). De individuele tubulineproteã nen wegen elk ~55kDa, dus bij ~110Da / aminozuur dat op de Orde van 500 aminozuren is. Zowel α – Als β-tubuline binden GTP, maar α houdt het vrijwel altijd vast, terwijl het in β kan worden geruild of gehydrolyseerd tot het BBP en dan weer kan worden geruild voor nieuwe GTP.

strengen van opeenvolgende α / β dimeren vormen protofilamenten, en 13 protofilamenten naast elkaar in een cilinder vormen een microtubule. De ruimte tussen de protofilamenten wordt een ‘naad’genoemd. De hele microtubule is ~ 25 nm in diameter. Je kunt de structuur (gemaakt van dimeren en protofilamenten) zien in het innerlijke leven van het Celsegment over microtubuli:

binnen elk dimeer is de β-subeenheid het ( + ) einde, dat de voorkeur heeft voor polymerisatie, en de α is het ( – ) einde, dat de voorkeur heeft voor depolymerisatie. Microtubuli vormen in principe dezelfde drie stappen als microfilamenten-nucleatie, verlenging en steady state. Maar in tegenstelling tot microfilamenten nucleeren ze niet gemakkelijk op hun eigen, dus nucleatie vereist microtubule organiserende centra (MTOCs). Niet-delende cellen hebben elk maar één MTOC, genoemd centrosome. (Dit is ook afgebeeld in de video hierboven). Gelegen nabij de kern, is centrosome hub aan een radiale configuratie van microtubules met (-) einden die binnen en (+) einden wijzen naar de celrand.

het centrosoom bestaat uit 2 cilinders die centriolen worden genoemd. Elk centriool bestaat uit elk 9 sets van 3 lateraal gefuseerde microtubuli, omgeven door een amorf ‘pericentriolair materiaal’ dat rijk is aan dingen die nucleatie bevorderen – in het bijzonder γ-tubulinringcomplexen (gamma tubuline wordt gecodeerd door de TUBG_ genen). γ-tubuline wordt beschouwd als een “gespleten wasmachine”:

het model is dat de gespleten uiteinden γ-tubuline in staat stellen zich te binden aan α-tubuline-d.w.z. het (-) uiteinde van een te vormen microtubuline-waardoor het nucleatiezaad voor de vorming van een microtubuline ontstaat.

microtubuli kunnen in vitro worden gevormd. De dynamiek hangt vooral af van kritische concentraties. Het ( – ) uiteinde is minder geneigd tot polymerisatie dan het ( + ) uiteinde, dus het heeft een hogere kritische concentratie. Als de werkelijke concentratie tussen de kritische concentraties van de twee uiteinden ligt, treedt een loopvlakverstrooiing op.

wanneer een microtubule plotseling begint te scheiden wordt dit een ‘catastrofe’genoemd. Catastrofes hebben interessante energetische dynamiek. Herinneren van eerder dat beta-tubuline, dat is het (+) einde waar elongatie gebeurt, kan ofwel GTP – of BBP-gebonden zijn. Het is een stabieler deel van zijn microtubule wanneer het GTP-gebonden is; BBP-gebonden tubuline is geschikt om te scheiden. Microtubuli vormen voornamelijk door toevoeging van GTP-gebonden bèta-tubuline aan het ( + ) einde, maar na toevoeging, hydrolyseren de bèta-tubulinemoleculen later hun GTP, waardoor ze BBP-gebonden zijn. Er is dus een soort’ tip ‘ van de microtubule die aan GTP gebonden is, terwijl bèta-tubuline dieper in de microtubule, langer geleden toegevoegd, aan BBP gebonden zijn. Als de grens van GTP-hydrolyse de top bereikt, of als er iets gebeurt om de microtubule te scheiden, dan wordt de minder stabiele, BBP-gebonden bèta-tubuline blootgesteld, en de protofilamenten zullen beginnen weg te pellen als “Ram’ s horns”. Als dit gebeurt, zal de microtubule demonteren tot het een “eiland” raakt van GTP-gebonden beta-tubuline ergens verderop in het stro. Catastrofe kan worden ‘gered’ door de toevoeging van nieuwe GTP-gebonden tubuline dimeren die de uiteinden afdekken en de protofilamenten stabiliseren, waardoor de microtubule zich opnieuw kan vormen. U kunt in deze video zien dat depolymerisatie van microtubuli veel sneller kan zijn dan polymerisatie:

hier zijn enkele verbindingen die nuttig zijn voor het bestuderen van microtubuli. Colchicine, een anti-jicht medicijn, bindt vrije alfa-beta dimeren, waardoor hun toevoer voor microtubulevorming wordt verminderd en zo depolymerisatie wordt bevorderd. Nocodazole interfereert ook met nieuwe microtubulevorming, en omdat de vorming van nieuwe microtubules belangrijk is voor mitose, is nocodazole een antineoplastisch kankermedicijn. Omgekeerd werkt paclitaxel (taxol), een ander geneesmiddel tegen kanker, door microtubuli te stabiliseren, aangezien de afbraak van bestaande microtubuli ook belangrijk is voor mitose.

Microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) hebben verschillende rollen. Opmerkelijk zijn MAP4 (in niet-neuronale cellen), MAP2 (in neuronen) en Tau (in neuronen; gecodeerd door MAPT gen). Al deze hebben gemeen dat zij handelen om microtubules te stabiliseren, het verschuiven van de kinetica ten gunste van microtubulegroei en tegen catastrofe. Elk bevat een 18 aminozuurrek met positief geladen aminozuren die aan het negatieve deel van microtubules binden. Zij kunnen handelen om veelvoudige microtubules samen te bundelen, met Map2 die de microtubules op een grotere afstand houden toe te schrijven aan zijn langere wapen (in vergelijking met Tau).

de kaarten worden geregeld door fosforylering: de TEKENPROTEÃ ne kinases binden fosfaatgroepen covalent aan aminozuren van S, T of Y in de KAARTPROTEÃ nen, die hun capaciteit verminderen om microtubules te binden. (Cyclin afhankelijke kinases regelen ook de kaarten tijdens mitose). Men denkt dat deze kaarten handelen om de fysieke structuur van cellen te bepalen. In neuronen wordt MAP2 gevonden in dendrieten en Tau bevindt zich meestal in het axon. Mutaties in het mapt-gen dat codeert voor Tau veroorzaken frontotemporale dementie (FTD). Hyperfosforylated Tau wordt gevonden (hoewel we niet weten waarom) in de hersenen van Alzheimer patiënten. Muismodellen van beide ziekten tonen axonale degeneratie, consistent met Tau niet in staat om zijn werk van het stabiliseren van microtubuli in het axon te doen.

een andere klasse van eiwitten, genaamd +Tips voor hun binding aan het ( + ) einde van microtubuli, kan beschermen tegen catastrofe. Ze lijken een eerlijke manier uit te breiden naar beneden in de microtubule. Deze video laat zien dat EB-1 naar buiten wordt geduwd omdat de uiteinden van microtubuli groeien:

andere eindbindende eiwitten bevorderen catastrofe in plaats van stabiliteit. Kinesin-13 handelt om het eind van de protofilamenten te krommen, die de drempel voor catastrofe verlagen. Stathmin (stmn1 gen; aka Op18, waar Op staat voor oncoprotein) bindt aan tubulinedimeren binnen een protofilament, het bevorderen van zowel onmiddellijke catastrofe en mogelijk ook GTP hydrolyse, die door het verwijderen van “eilanden” van GTP-gebonden bèta-tubuline meer van een lange termijn investering in het voordeel van catastrofe zou vertegenwoordigen. Stathmin wordt gereguleerd door fosforylering. Katanin (naar het Japanse zwaard katana) scheidt letterlijk microtubuli.

microtubule motoreiwitten zijn grotendeels vergelijkbaar met microfilament motoreiwitten. Ze komen in twee families: kinesins, waarvan de meeste bewegen anterograde dwz naar het ( + ) einde; en dyneins, waarvan de meeste retrograde dwz naar het (-) einde. Zij ‘lopen’ als volgt:

kinesine en dyneïne zijn betrokken bij bewegende organellen, endocytose en exocytose, en chromosoomsegregatie tijdens meiose & mitose.

kinesine-1, het best bestudeerde kinesine, is een ‘conventioneel’ kinesine in die zin dat het werkt als een tetrameer dat bestaat uit twee zware keteneenheden (kif1-genen, bijv. KIF1A) die de ‘hoofd’ domeinen omvatten die ATP hydrolyseren en de microtubules, en twee lichte kettingeenheden (KLC genen b.v. KLC1) binden die een ‘staart’ omvatten die de lading, in dit geval blaasjes bindt. Een linker domein (van welk eiwit is dit onderdeel?) zorgt voor dimerisatie van twee zware kettingen.

hier is een video van het in actie. Merk op dat de video noemt het een dimeer in plaats van een tetramer; ik denk dat dat komt omdat ze alleen rekening houden met de hoofden en niet bespreken de staarten.

sommige andere kinesinen verschillen enigszins:

• kinesine-2, dat ook blaasjes & organel transport doet, is een heterotrimer met twee verschillende (hoewel verwante) zware kettingen en een ander polypeptide dat het gebruikt om zijn lading te reguleren.
• kinesine-5 heeft kop aan beide uiteinden in plaats van kop en staart, zodat het in tegengestelde richtingen loopt op twee verschillende microtubuli, die ze samen trekken. Dit wordt ‘bipolaire beweging’genoemd.
• kinesine-14 is de enige bekende kinesine die naar het (-) eind beweegt en is betrokken bij mitose.

de principes van de’ walking ‘ beweging zijn vrijwel hetzelfde voor alle kinesins, hoewel, en zijn wat is afgebeeld in de laatste video hierboven. Wanneer niet gebonden aan een microtubule, de ‘heads’ zijn beide ADP-gebonden. Eén hoofd zal een microtubule tegenkomen en aan het binden, die zijn ADP vrijgeven, toestaand een ATP om het te vervangen. De ATP-band veroorzaakt conformational verandering die op linker trekt, het andere slingeren, ‘achterblijvende’ hoofd naar voren in belangrijke positie waar het aan de microtubule bindt. Het originele hoofd hydrolyseert dan ATP dat fosfaat vrijmaakt (dat in de video als Pi wordt afgekort) en voorziet de energie voor de ene energetisch bergop stap in dit proces, dat van de microtubule afbreekt.

myosine (het motoreiwit dat op microfilamenten loopt) en kinesine hebben zeer vergelijkbare structuren, maar geen overeenkomst met de aminozuurvolgorde. Men gelooft dus dat ze geen paralogs zijn, maar eerder een voorbeeld van convergente evolutie.

mensen praten veel over kinesines, deels omdat we dyneins niet zo goed begrijpen. Dyneins zijn enorme proteã nen, gemaakt van 2 grote, 2 tussenliggende en 2 kleine subeenheden. Door hun omvang zijn ze moeilijk te isoleren en te karakteriseren en hun werking wordt niet goed begrepen. We weten wel dat het dynactinecomplex (een multi-eiwitcomplex; de dynactines zelf zijn de dtcn_ genen) betrokken is als een ‘adapter’ die dynein verbindt met cargo.

deze video vat het hele cytoskelet en touwen samen in veel van het materiaal van vorige week en deze lezing:

PrP

zoals vermeld in de secretoire pathway notes, PrP is GPI-verankerd aan het membraan en ondergaat endocytose zeer regelmatig, waardoor endocytische blaasjes met PrP in hen. Encalada 2011 vindt dat Kinesin-1C en DHC1 (dynein zware keten 1) verantwoordelijk zijn voor het transport van deze PRP blaasjes anterograde en retrograde respectievelijk. Toen Encalada knock-out sloeg, neer sloeg of remde Kinesin-1C, werden anterograde en retrograde beweging verminderd, en op dezelfde manier toen DHC1 werd verstoord. Dus het lijkt erop dat deze twee complexen, hoewel ze in tegengestelde richtingen bewegen, elkaar activeren. Interessant is dat het verstoren van deze motorische eiwitten niet verhinderde dat PRP blaasjes geassocieerd werden met motoren – ze bewogen gewoon niet zo snel of zo vaak. Het document heeft een aantal andere conclusies van celbiologie over de aard van hoe blaasjes motorproteã nen activeren en hoe de richting van vervoer wordt bepaald.