Clostridium difficile toxine B

wanneer het katalytische threonineresidu van glucosyltransferase een familie van kleine Gtpasen, bijvoorbeeld de Rho-familie, Rac en Cdc42 in de doelcellen, de signaaltransductiemechanismen verstoort, wat leidt tot disfunctioneren van actinecytoskelet, cel-celverbinding en apoptose (Fig. 5). Rho induceert de activiteit van actine stress vezels. RAC-eiwitten controleren de activiteiten van membraanstoring en NADPH-oxidase neutrofiel. Cdc42 regelt de F-actine filamentvorming in filopodia.

Cytotoxiciteitedit

verscheidene studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van TcdB in zoogdiercellen tot snelle veranderingen binnen celmorfologie en cel het signaleren leidt. Binnen een korte periode van tijd, cellen hebben het uiterlijk van plaque met kleine doseringen van TcdB en TcdA. Bovendien is de dood van de cellen een belangrijke invloed van deze toxines nadat de cellen zijn bedwelmd. Een onderzoek door Donta et al., doorgestuurd dat tcdb heeft ernstige gevolgen in andere zoogdiercellen zoals Chinese hamster ovariumcellen, menselijke cervicale epitheliale cellen, muis bijniercellen, Rat hepatocyten en rat astrocyten (Fig.3).

de cytotoxische activiteit is gebaseerd op celtypen, die 4-voudig tot 200-voudig kunnen variëren. Over het algemeen, wanneer de cellen met TcdB worden besmet, verliezen zij niet alleen hun structurele integriteit, maar ook verminderingen van F-actin gloeidraden. Cell roundings door TcdB duren niet langer dan 2 uur (Fig. 4), maar voor zover celdood gaat, kan het ongeveer 24 uur duren. Met betrekking tot Clostridium difficile-geassocieerde diarree (CDAD), zijn de gevolgen van cytopathicity kritischer dan daadwerkelijke celdood omdat zodra cellen integriteit van het cytoskelet actine filament verliezen, verliezen zij ook zijn normale functie.

Effects on small Gtpasedit

de oorzaak van cytotoxische activiteit door TcdB binnen de gastheercel wordt hoofdzakelijk gemedieerd via receptor endocytose. De zure endosomes staan toxine B toe om cytosol in te gaan. Dit fenomeen vindt plaats door een bindingsreceptorgebied, dat toxine toelaat om gastheercellen in te gaan. Door de toegankelijkheid van cytosol van de gastheercellen, deactiveert tcdb de kleine GTPases (Fig. 5), bijvoorbeeld de Rho-familieleden Rac en Cdc42 door het proces van glycosylatie van threonine 35 in Cdc42 en Rac, en threonine 37 in Rho. Deze Rho GTPases worden gevonden ubiquitously in cytosol van eukaryotic cellen die van de organisatie van actin cytoskeleton verantwoordelijk zijn omdat de toxines in cytosol condensatie van actin filamenten als gevolg van cel het afronden en membraan het blebbing veroorzaken (Fig. 3), wat uiteindelijk leidt tot apoptosis. TcdB veroorzaakt kritische veranderingen in de celdynamiek en morfologie. Figuur 3 toont het waarschijnlijke effect van toxine B op het oppervlak van een cel; membraan blebbing (zwarte pijlen). Daarnaast inactiveert Tcdb Rho GTPases. Als gevolg daarvan worden cel-celverbindingen verstoord, wat de epitheliale permeabiliteit van toxine B en vochtophoping in het lumen verbetert. Dit is een van de belangrijkste veroorzakers in het contracteren van Clostridium difficile-geassocieerde diarree (CDAD)(Fig. 5).

bovendien is de snelheid van hydrolyse door TCDB van UDP-glucose ongeveer vijf keer groter dan TcdA. Verscheidene studies hebben erop gewezen dat Rho posttranslational wijziging door prenylation en carboxymethylation tentoonstelt, die in de cytoplasmic kant van het plasmamembraan, vandaar, de uitwisseling van GTP aan BBP voorkomt. Wanneer TcdB bindt aan Rho en andere kleine GTPases, hydrolyseert GTP aan het BBP, wat leidt tot GTP-gebonden (actief) aan het BBP-gebonden (inactief) (Fig. 5). Bovendien wordt deze uitwisselingsactiviteit geregeld door guaninefactoren in cytosol van de cel.

verstoring van het signaalpad edit

de cellulaire regulatie van Rho, Rac en Cdc42 heeft effecten buiten de nabijheid van de actine filamenten van het cytoskelet (Fig. 4), worden deze kleine GTPases opgenomen in de celcyclus die signalen via mitogen-geactiveerde eiwitkinasekinases (MAPKKs) regelt. Sommige fysiologische delen van de cellen die niet betrokken zijn bij actin gloeidraden, kunnen cel het afronden of celdood niet direct veroorzaken, maar in stroomafwaartse wegactiviteit, kunnen tot de verslechtering van actin gloeidraden en tenslotte, celdood leiden.

in 1993, een studie uitgevoerd door Shoshan et al., toonde aan dat cellen met TcdB fosfolipase A2 activiteit veranderden. Dit was een onafhankelijke gebeurtenis van verstoring van actin cytoskeleton. Shoshan et al., toonde ook aan dat TcdB de receptor signalerende activiteit remde door de Rho proteã NEN via phospholipase D te deactiveren.

Porievormingedit

TcdB heeft toegang tot de binnenkant van de cel via clathringemedieerde endocytose, wanneer toxine B deel uitmaakt van het cytosol, gaat de glucosyltransferase door het endosomale membraan, dat de pH verlaagt, translocatie induceert en uiteindelijk morfologische veranderingen van translocatieregioresiduen veroorzaakt (958-1130). De hydrophobic gebieden zijn ingebed in het gastheermembraan om poriën te vormen die glucosyltransferasedomeinen toestaan om door te gaan. Wanneer cellen besmet zijn met TcdB in een zure omgeving, verzwakt het toxines en veroorzaakt het vormherschikkingen (Fig. 6). Als gevolg van zure pH, toont tcdb duidelijke verschillen in originele fluorescentie van tryptofaan, gevoeligheid van proteasen, en hydrofobe oppervlakken. Een andere groep heeft aangetoond dat verzuring leidt tot conformationele veranderingen van de toxine en, belangrijker, helpt om poriën te vormen. Een zogenaamd translocatiegebied ( Fig. 2) bestaat uit ongeveer 801-1400 aminozuren, waarvan de residuen 958-1130 hydrofoob zijn en verantwoordelijk zijn voor de vorming van transmembraanporiën. Een meerderheid van de studies gebruikte tcdb-stam 630 om de porievormingsactiviteit van C. difficile toxines aan te tonen.

geïnduceerd door pHEdit

om te zien of de effecten van proteolytische splitsing van TcdB plaatsvinden aan het celoppervlak of in zure endosomen, werd gebruik gemaakt van Bafilomycine A1, waarvan bekend is dat het de V-Type H+-Atpasen van endosomen blokkeert. Dit vermindert de zuurgraad in endosomes. De fysiologische opnameroute van TcdB voorkomt cytopathische activiteit door TcdB. Wanneer cellen in zure omstandigheden (pH 4,0) gedurende 5 minuten na binding TcdB aan het celoppervlak bij 37 graden Celsius, werden de vorm herschikkingen en afronding waargenomen. Wanneer echter afgeronde cellen gedurende een extra uur in neutrale pH (7,0) met vergelijkbare parameters werden geïncubeerd, werd geen celafronding waargenomen. Beide studies toonden aan dat toxine B een eigenschap van proteolytische splitsing heeft, die voor toegang tot cytosol kritiek is. Het hebben van een zure endosoom pH leidt tot topologische veranderingen van TcdB (Figuur 6).

GeneticsEdit

het gen dat codeert voor het tcdb-eiwit, tcdB, bevindt zich binnen het chromosomale gebied van 19,6 kb. Dit is bekend als de plaats van pathogeniteit of PaLoc (Figuur 2). Het open leesframe (ORF) voor tcdB is 7.098 nucleotiden in lengte. Het is belangrijk om te vermelden dat—naast de belangrijkste toxinegenen in het PaLoc-gebied-er drie andere bijkomende genen zijn die coderen in het PaLoc-gebied.: tcdR (L), tcdC (R) en tcdE in het midden. Deze genen helpen om tcda en tcdb uitdrukking te regelen. Ze helpen ook om de toxines uit de cel te scheiden of vrij te geven. Het coderende gen tcdE, gelegen tussen tcdB en tcdA, is analoog aan holin proteã nen, dus, wordt voorgesteld dat tcdE werkt als een facilitator gen dat de afgifte of secretie van tcda en tcdb verbetert bijgevolg het verhogen van de permeabiliteit van de gastheercelmembraan.

Toxinedetectiedit

er zijn verschillende plasmidegroottes van C. difficile. De gedetecteerde molecuulgewichten variëren van 2, 7×106 tot 100×106, maar plasmidegroottes vertonen geen correlatie met toxiciteit. Om het niveau van toxine B in C. difficile te ontdekken, gebruiken de artsen uitgebreid de analyses van de celcultuur die van ontlastingsspecimens van patiënten met PMC worden afgeleid. De celcultuurtest wordt beschouwd als een” gouden standaard ” voor het opsporen van toxiciteit bij C. difficile omdat een kleine hoeveelheid toxine B in staat is celafronding te veroorzaken (Fig. 4), dus, het is een groot voordeel van klinische laboratoria om correlaties met de CDAD veroorzaakt door TcdB te maken. Hoewel de cytotoxische activiteit van grote clostridiale toxinen (LCT ‘ s) werd gevonden in PMC-patiëntkrukmonsters, had de activiteit van toxine B meer schadelijke cytotoxische effecten in vergelijking met toxine A. Daarom wordt de activiteit van toxine A verzwakt wanneer het niet wordt geïsoleerd uit toxine B. De detectie van C. difficile toxiciteit is uiterst gevoelig, echter, met behulp van de celcultuurtest kunnen klinische laboratoria de uitdaging overwinnen; met behulp van doses zo weinig als 1 pg / mL toxine B is genoeg om de cel afronding veroorzaakt. Dit is het belangrijkste voordeel in het gebruik van de test van het cultuurweefsel om toxiciteit bij PMC-patiënten te ontdekken. Hoewel klinische laboratoria hebben geprobeerd om een analyse microtiter plaat enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) en andere technieken te gebruiken om de cytotoxische activiteit van toxine B in de ontlasting van PMC patiënten te detecteren, zijn de resultaten niet zo nauwkeurig als die waar de celkweek assays werden gebruikt.

productiefactor

door toevoeging van antimicrobiële middelen, bijv. clindamycine, in de cultuur groeimedium, studies hebben aangetoond dat de cytotoxische activiteit in C. difficile culturen toeneemt met 4-8 vouwen. Bovendien, het kennen van de rol van antibiotica op de oorzaken van PMC, veel eerdere studies gericht op de effecten van antimicrobiële productie van toxines. Als gevolg hiervan konden studies concluderen dat de subinhibitieve aard van vancomycine en penicilline niveaus de toxineproductie in culturen van C. difficile verhoogden. De hoeveelheden toxine productie werden gecorreleerd met het gebruik van groeimedium voor de organismen. Een andere studie toonde aan dat de hoge niveaus van toxine productie van TcdB werden waargenomen in complexe media zoals hersenen en hart infusie bouillon. Hoge niveaus van toxines werden geproduceerd met isolatie van zeer virulent. Omgekeerd, lage niveaus van toxines werden geproduceerd met isolatie van zwak virulent. Het toont dus aan dat de productie van toxines mede gereguleerd werd. Hoewel het mechanisme achter de betrokkenheid van het milieu bij het moduleren van de signalen die de toxines uitdrukken niet wordt begrepen, hebben in vitro studies aangetoond dat de expressie van toxine wordt versterkt door kataboliet onderdrukking en stress, bijvoorbeeld antibiotica. Een andere studie heeft aangetoond dat het beperken van biotine in goed gekarakteriseerd medium de productie van tcdb met 64-voudig en tcda met 35-voudig verhoogt. Dit werd gedaan met C. difficile en dosissen biotine zo klein zoals 0,05 nM. Verschillende andere vroege studies hebben aangevoerd tegen de theorie dat de productie van toxine iets te maken heeft met stress of kataboliet onderdrukking van ofwel toxine tcda of TcdB. Ook veel studies zeggen dat de belangrijkste reden voor de verschillen tussen andere studies is te wijten aan toxine productie niet optreedt met alle isolaten van C. difficile.