Establishment of a Competitive Binding Assay Identifying the Different Characteristics of Neutralizing Epitopes of Hepatitis E Virus

Abstract

doelstellingen: bevestigen van de verschillende karakteristieken van genotype-specific and common neutralizing epitopes of hepatitis E virus (HEV). Methode: Een competitieve bindingstest werd vastgesteld met bekende genotype-gemeenschappelijke neutraliserende monoklonale antilichamen (mAbs) 3G1 en 5G5 evenals genotype-specifieke neutraliserende mAbs 2B1 en 4C5. HEV ORF2 recombinant p166w01 afgeleid van genotype 1 en p166Chn afgeleid van genotype 4 werden gebruikt als gecoate antigenen om te bepalen of de mAbs onafhankelijke, soortgelijke of overlappende epitopen herkennen. mAbs werden geproduceerd, gezuiverd en geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP). HRP-geconjugeerd 2B1 kon alleen reageren met p166W01 maar niet met p166Chn, HRP-geconjugeerd 4C5 kon alleen reageren met p166Chn maar niet met p166W01, terwijl HRP-geconjugeerd 3G1 en 5G5 zowel met p166W01 als p166Chn konden reageren. Aldus, werden de concurrerende bindende analyses uitgevoerd achtereenvolgens gebruikend p166w01 en p166chn antigeen. Resultaten en conclusie: de resultaten van competitieve bindingstests toonden aan dat de binding van HRP-geconjugeerd 2B1 aan p166W01 niet kon worden geremd door 5G5 of 3G1. Evenzo kon de binding van HRP-geconjugeerd 4C5 aan p166Chn niet worden geremd door 5G5 of 3G1. Nochtans, blokkeerden de mAbs 5G5 en 3G1 elkaars band aan p166W01 en p166Chn, die suggereren dat gemeenschappelijke en genotype-specifieke neutraliserende mAbs onafhankelijke epitopen erkennen.

© 2018 S. Karger AG, Bazel

introductie

Hepatitis – E-virus (HEV) is een niet-ontwikkeld, positief-streng RNA-virus dat voornamelijk via de orale route wordt overgedragen en bij de mens acute hepatitis-E veroorzaakt . HEV-infectie kan leiden tot schadelijke prognosten, bijvoorbeeld levensfalen, ernstige acute hepatitis, chronische infectie in het getransplanteerde orgaan en bij immunosuppressiepatiënten, en hoge mortaliteit bij zwangere vrouwen . Naast bevestigde infectie bij mensen infecteren HEV ‘ s ook dieren en kunnen ze van dieren op mensen worden overgedragen; de incidentie van hepatitis E-infectie in de ontwikkelde landen is ook aanzienlijk toegenomen . Deze bevindingen wijzen erop dat HEV een bedreiging vormt voor de volksgezondheid over de hele wereld .

hoewel één serotype is herkend, kunnen HEV-isolaten, afkomstig uit verschillende gebieden over de hele wereld, worden ingedeeld in vier belangrijke genotypen . HEV ‘ s van genotypen 1 en 2 verschillen van genotypen 3 en 4 in hun epidemiologische, antigene en immunogene kenmerken .

tot op heden is onderzoek naar antigene epitoopkarakterisatie voornamelijk gebaseerd op het structurele HEV-eiwit voor een in vitro kweeksysteem niet beschikbaar . pORF2 is de belangrijkste structurele eiwithev die door ORF2 wordt gecodeerd, die 1 van 3 overlappende open lezingskaders (ORFs) van het virale genoom is . De belangrijkste immunogene regio ‘ s van pORF2 zijn gelokaliseerd in de C-terminal 2/3 regio, die de belangrijkste doelen waren voor de ontwikkeling van het vaccin .

ons vorige onderzoek heeft het bestaan aangetoond van een immunogeniciteitsverschil tussen het hepatitis E-vaccin p179 (439-617 aminozuren van het ORF2-eiwit) afgeleid van genotype 4 en p239 (Hecolin) afgeleid van genotype 1; het verschil kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van HEV-genotype-specifieke epitoop(n) . Monoklonale antilichamen (mAbs) geproduceerd in muizen die respectievelijk geïmmuniseerd zijn met p166sar(452-617 aminozuren van het ORF2-eiwit) afgeleid van genotype 1 en p166chn afgeleid van genotype 4, zijn gebruikt om de aanwezigheid van GE notype-specifieke epitoop (s) te bevestigen. Naast 2 genotype-gemeenschappelijke neutraliserende mAbs, 3G1 en 5G5, werden ook 2 genotype-specifieke neutraliserende mAbs, 2B1 en 4C5, verkregen. 2B1 tegen p166Sar kon zich specifiek binden aan recombinante eiwitten van genotype 1 en 2 en in vitro alleen geneutraliseerde stammen van genotype 1 en 2; 4C5 tegen p166Chn immunoreageerde specifiek tegen recombinante genotypen 3 en 4 eiwitten en neutraliseerde alleen genotype 3 en 4 stammen, terwijl 3G1 tegen p166Sar en 5G5 tegen p166Chn konden binden aan recombinante genotypen 1-4 eiwitten en geneutraliseerde 4 genotype stammen . Voor verdere studie van de verschillende kenmerken van genotype-gemeenschappelijke en genotype-specifieke neutraliserende epitopen van HEV, werd een competitieve bindende assay ontwikkeld gebruikend mAbs 2B1, 3G1, 4C5, en 5G5, om te bevestigen of epitopen die door mAbs worden erkend onafhankelijk, gelijkaardig, of overlappend zijn.

materialen en methoden

recombinante eiwitten

Recombinant P166 was een afgekapt eiwit van pORF2, de nucleotidesequenties werden afgeleid van de volgende HEV-stammen: W01 (genotype 1, JX857689) en China-9829 (genotype 4, AY789225). Recombinante plasmiden werden geconstrueerd en tot expressie gebracht in Escherichia coli . De 2 zijn-geëtiketteerde p166 proteã nen werden aangewezen als p166W01 en p166chn, respectievelijk.

mAb-productie

in totaal werden 4 eerder beschreven neutraliserende mAbs, 2B1, 3G1, 4C5 en 5G5 gebruikt om een competitieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) te ontwikkelen. 2B1 en 3G1 werden verhoogd tegen p166Sar; 4C5 en 5G5 werden verhoogd tegen p166Chn . De mAbs werden geproduceerd door 106 hybridoma-cellen in de buikholte van een BALB/C-muis te injecteren; ascites-vloeistof met mAbs werd na 7-10 dagen geoogst, gefilterd, gecentrifugeerd en opgeslagen bij -80°C .

zuivering van mAbs

de MAB ascites vloeistof werd gezuiverd met behulp van proteïne g-sefarose kolom affiniteit chromatografie (Sigma, Duitsland). Fracties die antilichaam bevatten werden verzameld met behulp van de zure elutiebuffer (0,1 m glycine-HCl, pH 2,8) uit het geïmmobiliseerde eiwit G en vervolgens bepaald bij 280 nm; de absorptie bij 280 nm (A280) kan worden gebruikt om de mAbs ruwweg te kwantificeren. De elektroforese van het natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel werd gebruikt om de gezuiverde fracties te bevestigen en te kwantificeren gebruikend runderserumalbumine .

koppeling van Mierikswortelperoxidase aan MABS

gezuiverde mAbs werd gedialyseerd tegen 100 mM carbonaat / bicarbonaatbuffer (pH 9,3) bij 4°C ‘ s nachts . Antilichamen werden gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) volgens de instructies van de fabrikant (KPL). Ongeveer 1,5 mg HRP werd gemengd met 0,5 mg mAb in 0,5 mL totaal volume van HRP conjugatiebuffer, door zachtjes te roeren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. het mengsel werd bij kamertemperatuur gedurende 15 min na 10 µl van het reductiemiddel toegevoegd, en dan, 1 volume gedistilleerde glycerol werd toegevoegd voor opslag en verder gebruik.

kruisreactiviteit van HRP-geconjugeerde mAbs met Heteroloog P166-antigeen

de ELISA-methode werd toegepast om de kruisreactiviteit van HRP-geconjugeerde mAbs met p166w01-en p166Chn-antigeen te bevestigen . Kort, putten van microplaten werden gecoat met 100 ng van de p166w01 en p166Chn antigeen, respectievelijk, geïncubeerd gedurende 2 uur bij 37°C. Dit werd gevolgd door verwijdering van gecoate antigenen; 200 µL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% boviene serumalbumine werden toegevoegd in Putten, en vervolgens microplaten werden geïncubeerd bij kamertemperatuur met zacht schudden. Twee uur later werd de blokkerende buffer weggegooid en werden de putten tweemaal gewassen met PBS met 0,05% Tween-20 (PBST). De tweevoudige verdunningen van HRP-geconjugeerde mAbs, variërend van 1: 400 tot 1: 25.600 in 1% caseïne PBS, werden in overeenkomstige putjes toegevoegd, gevolgd door 45 minuten incubatie bij 37°C; caseïne PBS werd verwijderd door 5 maal te wassen met PBST. Tetramethylbenzidine vloeibaar substraat werd toegevoegd voor kleurontwikkeling voor incubatie bij 37°C gedurende 10 min. Tot slot werd de optische dichtheid (OD) van elke put afgelezen bij 450 nm, met een 630 nm referentiegolflengte.

bepaling van antigeen-en mAb-Titers

de titers van antigeen en mAbs werden bepaald met behulp van een ELISA. Aanvankelijk werden seriële 2-voudige verdunningen van HRP-geconjugeerde mAbs die zich van 1: 400 tot 1: 25.600 in 1% caseïne PBS uitstrekken bereid, dan toegevoegd aan putten die met seriële verdunningen van p166w01 of p166chn antigeen worden voorgecoat. Gevolgd door een incubatietijd van 45 minuten bij 37°C werden ongebonden mAbs verwijderd door 5 maal te wassen met PBST. Tetramethylbenzidine vloeibaar substraat werd toegevoegd voor kleurontwikkeling voor een incubatie van 10 minuten bij 37°C. Tot slot werd de OD van elk goed gelezen bij 450 nm, met een 630-nm referentiegolflengte, om de verdunning te bepalen die subsaturating was en een od lezing van ongeveer 1.0 bij 450 nm gaf, met een 630-nm referentiegolflengte.

competitieve Binding Assay

de verschillende karakteristieken van de vaak voorkomende en genotype-specifieke neutraliserende epitopen van HEV werden onderzocht met behulp van een paarsgewijze competitieve binding assay vastgesteld met common en genotype-specifieke neutraliserende mAbs . De methoden waren vergelijkbaar met de hierboven beschreven procedures, behalve dat p166W01 en p166Chn respectievelijk als coatingantigeen werden gebruikt en mengsels van HRP-geconjugeerde mAb bij tweemaal de concentratie en een verzadigde concentratie van niet-geconjugeerde mAb aan de gecoate putjes werden toegevoegd. De OD werd gemeten bij 450 nm, met een referentiegolflengte van 630 nm. De procentuele remming werd berekend met de formule: 100 × . De concurrentie werd als positief beoordeeld als het inhibitiepercentage meer dan 50% was.

resultaten

kruisreactiviteit van HRP-geconjugeerde mAbs met Heteroloog P166-antigeen

de ELISA-methode werd toegepast om de kruisreactiviteit van HRP-geconjugeerde mAbs met p166w01-en p166Chn-antigenen te evalueren. De resultaten toonden aan dat HRP-geconjugeerde 2B1 bij verdunningen van 1: 400 tot 1: 25.600 alleen reageerde met p166W01, maar niet met p166Chn, en HRP-geconjugeerde 4C5 bij verdunningen van 1: 400 tot 1: 25.600 alleen reageerde met p166Chn. Daarentegen reageerden HRP-geconjugeerd 3G1 en 5G5 bij verdunningen van 1: 400 tot 1: 25.600 goed met de 2 p166 eiwitten (Fig. 1). Deze waarnemingen waren vergelijkbaar met de vorige bevindingen, 2B1 en 4C5 zijn genotype-specifieke mAbs, terwijl 3G1 en 5G5 genotype-gemeenschappelijke mAbs zijn .

bepaling van P166w01-antigeen en HRP-geconjugeerde mAb-Titers voor de competitieve Bindingstest

p166W01-antigeen werd gebruikt om de competitieve bindingstest van mAbs 2B1, 3G1 en 5G5 vast te stellen; de juiste titers van mAbs en antigeen werden bepaald met ELISA. Zoals weergegeven in Tabel 1, was de gemiddelde OD-waarde na vierkante titratie, wanneer de verdunning van het p166w01-antigeen 1: 400 was, en HRP-geconjugeerd 2B1 1: 6400, dicht bij 1,0. Ondertussen waren, zoals blijkt uit Tabel 2, Wanneer de verdunning van antigeen 1: 400 was, HRP-geconjugeerd 5G5 en HRP-geconjugeerd 3G1 respectievelijk 1: 6.400 en 1: 12.800, en de gemiddelde OD-waarde was dicht bij 1,0.

Bepaling van p166Chn Antigeen en HRP-Geconjugeerd mAb Titers voor de Competitieve Binding Assay

p166Chn antigeen werd gebruikt om de competitieve binding assay van mAbs 4C5, 3G1, en 5G5, de juiste titers van mAbs en antigeen waren ook bepaald met behulp van ELISA. Zoals weergegeven in Tabel 3, was de verdunning van het p166chn-antigeen na vierkante titratie 1: 800, HRP-geconjugeerd 4C5 1: 6400 en de gemiddelde OD-waarde dicht bij 1,0. Ondertussen waren, zoals blijkt uit Tabel 4, wanneer de verdunning van het antigeen 1: 800 was, de verdunningen van HRP-geconjugeerd 5G5 en HRP-geconjugeerd 3G1 respectievelijk 1: 6.400 en 1: 12.800; de gemiddelde OD-waarde was dicht bij 1,0.

remming van de Binding van mAbs aan p166W01

de resultaten van remming worden weergegeven in Tabel 5; de binding van HRP-geconjugeerd 2B1 aan p166W01-antigeen werd geremd door ongeconjugeerd 2B1 met 68% remming. Er was geen significante remming tussen 2B1 met mAbs 5G5 en 3G1 (27 en 30%). Meer volledige remming werd verkregen van heterologe mAbs 3G1 en 5G5, want de binding van HRP-3G1 aan antigeen werd geremd door 5G5 met 61% remming, HRP-geconjugeerd 5G5 aan antigeen werd geremd door 3G1 met 99% remming. De Binding van HRP-3G1 en HRP-5G5 aan p166w01-antigeen werd ook bijna volledig door zichzelf geremd (81 en 80% remming). Deze resultaten suggereren dat 3G1 en 5G5 dezelfde epitoop of overlappende epitoop kunnen delen, maar 2B1 herkent waarschijnlijk een andere epitoop.

Remming van de Binding van mAbs te p166Chn

De resultaten van remming zijn weergegeven in Tabel 5: de binding van HRP-4C5 te p166Chn werd geremd door unconjugated 4C5 met 69% remming, er was geen significante remming (25 en 30%) verkregen van de andere 2 unconjugated mAbs 3G1 en 4C5. Er werd echter een hogere remming verkregen door HRP-geconjugeerde mAbs 3G1 en 5G5-binding aan antigeen, geremd door ongeconjugeerde 5G5 en 3G1 met een remming van 65 en 76%. De Binding van HRP-geconjugeerd 3G1 en HRP-geconjugeerd 5G5 aan p166Chn-antigeen werd ook bijna zelf geremd. Deze resultaten suggereren ook dat 3G1 en 5G5 dezelfde epitoop of overlappende epitoop kunnen delen, terwijl 4C5 waarschijnlijk een andere epitoop herkent.

discussie

sinds de nieuwe HEV van varkens voor het eerst geïsoleerd werd , zijn anti-HEV-antilichamen bij veel dieren gemeld, hebben HEV-infectie bij dieren en mensen aangetoond, en dit kan van dieren op mensen worden overgedragen . De vermindering van hepatitis E morbiditeit en mortaliteit was afhankelijk van vaccinpreventie en effectieve diagnose. Kennis van epitopen van HEV was essentieel voor de vaccinvoorbereiding en diagnostische ontwikkeling . De opsporing van specifieke antilichamen in serum is één van de belangrijkste kenmerkende methodes, en er is een groeiend aantal serologische analyses voor antilichaamopsporing. Nochtans, variëren de analyses die worden gebruikt om specifieke antilichamen te ontdekken aanzienlijk in gevoeligheid . Sommige commerciële diagnostische tests op basis van genotype 1-of 2-antigenen leveren geen serumantilichamen op tegen genotype 3-of 4-isolaten . Er is weinig bekend over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de noncorrespondentie van de verschillende diagnostische analyses.

momenteel is een in vitro celcultuursysteem nog steeds niet beschikbaar voor HEV-onderzoek. Daarom is pORF2 die de meeste immunogene plaatsen bevatten wijd gebruikt voor immunologische studie van HEV, met een bouw-afhankelijk karakter . De structurele basis van een immunogeen om neutraliserende en beschermende antilichamen op te wekken is het neutraliserende epitoop, dat het belangrijkste doel van de ontwikkeling van het hepatitis E-vaccin is . We hebben eerder gemeld dat het p166-eiwit, een afgekapt eiwit van pORF2, HEV-neutraliserende epitoop(s) kan modelleren en antilichamen tegen p166 verschillende genotypes van HEV kunnen neutraliseren . Bovendien was het hepatitis E p239-vaccin afgeleid van genotype 1 HEV effectief in een fase 3 klinisch onderzoek uitgevoerd in de provincie Jiangsu, China, waar het epidemische HEV-isolaat genotype 4 is . Deze bevindingen onthulden gemeenschappelijke neutraliserende epitoop (s) bestaan binnen de verschillende genotypes van HEV. Naast de gemeenschappelijke neutraliserende epitoop(s), genotype-spe cific epitoop (s) is ook bevestigd om te bestaan, voor mAb voorbereiding en karakterisering .

om de karakterisering van gemeenschappelijke en genotype-specifieke neutraliserende epitopen verder te identificeren, werd de competitieve inhibitietest vastgesteld met gemeenschappelijke neutraliserende mAbs, 3G1 en 5G5, en genotype-specifieke neutraliserende mAbs, 2B1 en 4C5, om de competitieve binding aan p166w01-of p166Chn-antigeen te onderzoeken en om te bepalen of de mAbs onafhankelijke, soortgelijke of overlappende epitopen herkennen.

aanvankelijk werden ascitische vloeistoffen van mAbs 3G1, 2B1, 5G5 en 4C5 geproduceerd, gezuiverd en geconjugeerd met HRP. De ELISA-methode werd toegepast om de bindende af-finiteit van HRP-geconjugeerde mAbs te vergelijken met verschillende genotypes van HEV p166. Uit de resultaten bleek dat HRP-geconjugeerd 2B1 alleen reageerde met genotype 1 p166W01, maar niet met p166Chn. Op dezelfde manier reageerde HRP-geconjugeerd 4C5 alleen met p166Chn. Daarentegen reageerden HRP-geconjugeerd 3G1 en 5G5 goed tegen de 2 genotype p166-eiwitten. Zo, zijn de concurrerende bindende analyses gebaseerd op de antigenen van genotype 1 en 4 HEV p166. De resultaten van concurrerende bindende analyses zijn niet verrassend, d.w.z. dat de binding van 2B1 aan p166W01 alleen op zichzelf concurreerde, terwijl 3G1 en 5G5 elkaar konden beconcurreren om de binding aan p166W01. Bovendien werd de binding van 4C5 aan p166Chn op dezelfde manier alleen op zichzelf geconcurreerd, maar 3G1 en 5G5 konden met elkaar concurreren voor de binding aan p166Chn. Deze bevindingen gaven aan dat 3G1 en 5G5 dezelfde of overlappende epitopen herkennen en dat 2B1 en 4C5 verschillende epitopen herkennen.

dit is de eerste studie waarin de verschillende kenmerken van genotype-gemeenschappelijke en genotype-specifieke conformationele neutraliserende epitopen van HEV worden onderzocht. We toonden aan dat gemeenschappelijke en genotype-specifieke neutraliserende epitopen onafhankelijk kunnen zijn. Deze ontdekking is zeer voordelig om de mechanismen aan te tonen die ten grondslag liggen aan de lage concordantie van de verschillende diagnostische analyses. Verdere studies zijn van cruciaal belang om de verschillende kenmerken van neutraliserende epitopen van HEV in de effectiviteit van diagnostische ontwikkeling en vaccinvoorbereiding te verduidelijken.

erkenning

dit werk werd ondersteund door de doctoral scientific research foundation van de Anhui Medical University (nr. 0110037101).

verklaring inzake openbaarmaking

de auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Auteur Contacten

Artikel / colofon

Copyright / Drug dosering / Disclaimer

Copyright: Alle rechten voorbehouden. Geen enkel deel van deze publicatie mag worden vertaald in andere talen, gereproduceerd of gebruikt in welke vorm of op welke wijze dan ook, elektronisch of mechanisch, met inbegrip van fotokopieën, opname, microscopie, of door een systeem voor het opslaan en ophalen van informatie, Zonder schriftelijke toestemming van de uitgever.
dosering van het geneesmiddel: de auteurs en de uitgever hebben alles in het werk gesteld om ervoor te zorgen dat de selectie en dosering van het geneesmiddel zoals beschreven in deze tekst in overeenstemming zijn met de huidige aanbevelingen en praktijk op het moment van publicatie. Gezien het lopende onderzoek, de wijzigingen in de overheidsvoorschriften en de constante stroom van informatie met betrekking tot medicamenteuze therapie en medicijnreacties, wordt de lezer echter verzocht de bijsluiter voor elk geneesmiddel te controleren op eventuele veranderingen in indicaties en dosering en op toegevoegde waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen. Dit is vooral belangrijk wanneer het aanbevolen middel een nieuw en/of zelden gebruikt geneesmiddel is.Disclaimer: De verklaringen, meningen en gegevens in deze publicatie zijn uitsluitend die van de individuele auteurs en bijdragers en niet van de uitgevers en de uitgever(s). Het verschijnen van advertenties of/en productreferenties in de publicatie is geen garantie, goedkeuring of goedkeuring van de geadverteerde producten of diensten of van hun effectiviteit, kwaliteit of veiligheid. De uitgever en de redacteur(s) wijzen de verantwoordelijkheid af voor eventuele schade aan personen of goederen als gevolg van ideeën, methoden, instructies of producten waarnaar in de inhoud of advertenties wordt verwezen.