Galesculin Test for Presumptive Identification of enterokokken en streptokokken: Effects of Galconcentratie, inoculatie techniek, en incubatietijd

herkenning en differentiatie van catalase-negatieve, Alfa-hemolytische en niet-hemolytische grampositieve cocci in paren en ketens als enterokokken; Groep D streptokokken (mainlyStreptococcus bovis); en niet-Groep D viridans groep streptokokken zijn klinisch belangrijk (10). De gal-esculine test wordt veel gebruikt om enterokokken en groep D streptokokken, die galtolerant zijn en esculine kunnen hydrolyseren tot esculetin, te onderscheiden van niet-Groep D viridans groep streptokokken, die slecht groeien op gal. Voor het eerst beschreven in 1926 door Meyer en Schonfeld (8), de gal-esculine test werd aangetoond door Facklam en Moody (2, 3, 5) een gevoeligheid van 100% en een specificiteit van 97% voor het identificeren van enterokokken en groep D streptokokken. Deze resultaten werden verkregen met agarschuinen met 4% oxgall (galzouten), geïnoculeerd met 1 of 2 druppels van een 24-uur Todd-Hewitt beide cultuur van het organisme (“next-day” inoculatie), en geïncubeerd gedurende 48 uur. in routine diagnostische bacteriologie, een dergelijk protocol is onpraktisch, omdat het vereist 3 dagen vanaf het moment dat kolonies worden gedetecteerd op primaire platen. De meeste handboeken en procedurehandleidingen bevelen het inoculeren van agar schuine kanten aan direct uit een paar kolonies (“dezelfde dag” inoculatie) in plaats van uit een 24-uur subcultuur in bouillon, maar gegevens die deze niet-standaard alternatieve techniek ondersteunen ontbreken.

daarom hebben we de gevoeligheid en specificiteit van de gal-esculine test geëvalueerd met twee verschillende methoden van inoculatie op dezelfde dag (gestandaardiseerd en niet-gestandaardiseerd) en twee verschillende incubatietijden (24 en 48 uur). We hebben ook esculine slants met 2 en 4% oxgall vergeleken in formuleringen die momenteel verkrijgbaar zijn bij twee belangrijke commerciële bronnen in de Verenigde Staten.

Catalase-negatieve, gram-positieve cocci in paren en ketens die alfa-hemolytische of niet-hemolytische kolonies vormen op 5% schapenbloedagar die positief waren voor PYR (Murex, Dartford, Verenigd Koninkrijk) en groeiden in tryptische sojabouillon met 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) werden geïdentificeerd als enterococcen; ze waren gespecialiseerd met het API Rapid Strep system (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Catalase-negatieve, grampositieve cocci in paren en ketens die alfa-hemolytische of niet-hemolytische kolonies vormden die negatief waren voor PYR, niet groeiden in 6,5% NaCl, positief waren voor groep D-antigeen door latexagglutinatie (Murex), en een suggestief (≥90% waarschijnlijkheid) biochemisch patroon door het API snelle Strep-systeem werden geïdentificeerd als S. bovis. Catalase-negatieve, grampositieve cocci in paren en ketens die alfa-hemolytische of niet-hemolytische kolonies vormen die negatief waren voor PYR en groep D-antigeen (en onoplosbaar waren in gal als Alfa-hemolytische) werden viridans-groepstreptokokken genoemd.

in totaal werden 110 enterokokkenstammen (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium en 61 niet-hemolytische en niet-gespecialiseerde stammen), 30 S. bovis-stammen (2 alfa-hemolytische en 28 niet-hemolytische stammen) en 110 streptokokkenstammen uit de groep D viridans (83 Alfa-hemolytische en 27 niet-hemolytische stammen) getest. De stammen werden achtereenvolgens geïsoleerd uit bloedculturen uitgevoerd in het Duke University Medical Center gedurende een periode van 4 jaar, met uitzondering van 19 S. bovisstrains die werden verkregen uit de Mayo Clinic.

verse (24-uur) bacteriën werden geïnoculeerd op drie verschillende esculine-agarafwijkingen die ofwel geen gal (BDMS), 2% oxgall (equivalent aan 20% gal) (BDMS), of 4% oxgall (equivalent aan 40% gal) bevatten (Remel, Lenexa, Kans.). Met uitzondering van oxgall waren de composities van de drie media hetzelfde. Voor elk medium werden de volgende twee inoculatietechnieken gebruikt: (I) directe, Niet-standaard S-vormige inoculatie van 1 tot 10 kolonies en (ii) indirecte, gestandaardiseerde inoculatie van 10 µl (gekalibreerde lus) van een 0,5 McFarland standaardsuspensie van bacteriën in steriel gedeïoniseerd water. De hellingshoeken werden bij 35°C in de omgevingslucht (2) geïncubeerd met losse doppen gedurende 48 uur. metingen werden gedaan bij 24 en 48 uur. een reactie werd als positief beschouwd wanneer de helft of meer van het medium zwart was (4).

met één uitzondering gaven alle 110 enterokokkenstammen duidelijke positieve reacties na 24 en 48 uur incubatie (99% gevoeligheid). Het gestandaardiseerde entmateriaal (ongeveer 106 CFU) was even gevoelig als het zwaardere, niet-gestandaardiseerde entmateriaal. Facklam en Moody rapporteerden, met een entmateriaal van 107 tot 108 CFU op agar-schuine vlakken, een gevoeligheid van 100% bij 48 uur, maar vonden 2 van 76 (5) en 6 van 157 (3) enterokokkenstammen na 24 uur incubatie galesculine-negatief (98% gevoeligheid). Swan (13), waarbij gebruik werd gemaakt van een niet-gestandaardiseerd entmateriaal dat als zwaar werd omschreven en van agarplaten waarop zwart worden als een positief resultaat werd beschouwd, bereikte een gevoeligheid van 100% bij 24 uur met 121 enterokokkenstammen. Niettemin, op basis van de publicaties van Facklam, de meeste leerboeken en procedurehandleidingen aanbevelen incubatie gedurende 48 uur voordat het melden van een negatief resultaat.

alle 30 stammen van S. bovis waren positief na 24 en 48 uur, ongeacht de galconcentratie of de inoculatiemethode (100% gevoeligheid). Facklam (3) rapporteerde een gevoeligheid van 94 en 100% bij respectievelijk 24 en 48 uur, met 37 streptokokkenstammen van Groep D.

Tabel 1 geeft de percentages vals-positieve galesculinetests voor 110 streptokokkenstammen uit de niet-Groep D viridans-groep. We vonden dat de specificiteit (100% minus het percentage vals-positief) maximaal was (97%) met een gestandaardiseerd entmateriaal gestreept op agar schuine 4% oxgall en gelezen na 24 uur. vals-positieven werden verkregen met twee Streptococcus milleriand een Streptococcus lactis subsp. diacetylactisstrains. Gebrek aan standaardisatie van het entmateriaal, afname van de oxgallconcentratie tot 2% en verlenging van de incubatietijd tot 48 uur, verhoogde het aantal valse positieven tot maximaal 24%. In eerdere studies met een selectieve esculine-agar die natriumazide bevat en slechts 10% gal, kwamen positieve reacties bij streptokokken uit de niet-Groep D viridans vaak voor (6, 11, 12). Er zijn eerder geen gegevens gepubliceerd over het gebruik van een medium met 2% oxgall. Onze resultaten suggereren dat deze concentratie suboptimaal is. Met behulp van 4% oxgall, vond Swan (13) twee galtolerante viridans groep streptokokken stammen uit 21 isolaten; geen van beide stammen, echter, gehydrolyseerd esculine op 24 uur. Facklam et al. gerapporteerde specificiteiten van 99% bij 24 uur (3) en 81 (4) tot 97% (3) bij 48 uur met 4% oxgall.

een opvallend verschil werd gevonden wanneer de subgroepen van Alfa-hemolytische en niet-hemolytische niet-Groep D viridans groep streptokokken werden vergeleken voor het aantal false positieven. Voor Alfa-hemolytische stammen was dit aantal 0% na 24 uur en 3% na 48 uur, terwijl het voor niet-hemolytische stammen 11% na 24 uur en 33% na 48 uur was, met 4% oxgall en een gestandaardiseerd entmateriaal (P = 0,017 voor 24-h waarden; two-tailed Fisher ‘ s exact test). Een dergelijke waarneming is niet eerder gemeld.

voor andere specimens dan bloed en normaal steriele plaatsen is een stroomdiagram op basis van de gal-esculinetest in combinatie met 6,5% NaCl-tolerantie of aanwezigheid van PYR voldoende voor een betrouwbare identificatie van enterokokken. Gal-esculine-positieve organismen uit het bloed en normaal steriele plaatsen moeten worden gespecificeerd. Speciatie van enterokokken is nuttig om epidemiologische redenen en omdat E. faecium en andere soorten meestal resistenter zijn tegen antibiotica dan E. faecalis (8, 9). Een definitieve identificatie van s. bovis is belangrijk, omdat het organisme geassocieerd is met coloncarcinoom, wat bij dergelijke patiënten moet worden uitgesloten (7). Aan de andere kant, vals-positieve meldingen van s. bovis kan leiden tot onnodig onderzoek. Speciatie van gal-esculine-positieve organismen zal ook de detectie van vals-positieve niet-Groep D viridans groep streptokokken mogelijk maken. Therapeutische fouten kunnen optreden bij verkeerde identificatie van streptokokken en enterokokken (1). Routinematige speciatie van gal-esculine-negatieve organismen is niet nodig, omdat enterokokken en groep D streptokokken zelden vals-negatieve reacties geven.

In conclusie, de gal-esculin test werkt goed om te snel een aparte enterokokken en groep D streptokokken van non-groep D viridans streptokokken groep tegen lage kosten en met een goede sensitiviteit (>99%) en specificiteit (97%), mits het wordt uitgevoerd op agar loopt met 40% gal, uitgevoerd met een gestandaardiseerd inoculum (10 µl van een 0.5 McFarland standaard bacteriële suspensie), en lees op 24 h.