Genetische kruisingen
een genetische kruising is de doelbewuste paring van twee individuen, resulterend in de combinatie van genetisch materiaal bij de nakomelingen. Kruisen kunnen in veel modelsystemen worden uitgevoerd – waaronder planten, gist, vliegen en muizen—en kunnen worden gebruikt om genetische processen te ontleden of organismen met nieuwe eigenschappen te creëren.
deze video zal enkele van de principes van genetische kruisingen behandelen, een methode voor het uitvoeren van kruisingen onderzoeken die bekend staat als tetrad-analyse, en verschillende toepassingen van deze techniek bespreken.
laten we eerst de basisprincipes van overerving introduceren die genetische kruisingen mogelijk maken.
het fenotype of de samenstelling van kenmerken van een organisme wordt beïnvloed door zijn genetische samenstelling of genotype. In de meeste seksueel reproducerende organismen, produceert de oudergeneratie haploïde gamete cellen, die één exemplaar van elk verschillend chromosoom hebben. Deze smelten dan tijdens het paren om een diploïde nakomelingen met twee homologe exemplaren van elk chromosoom te produceren. Als beide chromosomen hetzelfde allel, of variant vorm van een gen bevatten, dan is het organisme “homozygoot” op die genetische locus; anders is het “heterozygoot.”
om de cyclus opnieuw te beginnen, genereert het diploïde organisme opnieuw haploïde gameten via meiose. Tijdens dit proces, ondergaan de twee homologe chromosomen “nieuwe combinatie,” waar beetjes van gelijkwaardige opeenvolgingen tussen het paar worden uitgewisseld. Dit proces schuift de ouderlijke allelen geërfd door elk nageslacht, waardoor hun genetische diversiteit.Een van de eerste mensen die systematische genetische kruisingen uitvoerde was de “vader van de genetica”, Gregor Mendel. Door de gemakkelijk te manipuleren erwtenplant te gebruiken, en een reeks eigenschappen met consistente patronen van overerving te onderzoeken, kon Mendel drie basiswetten van overerving afleiden die de basis van genetica zouden vormen.Mendels eerste wet is de wet van uniformiteit, die stelt dat de heterozygote nakomelingen van de eerste, of F1, generatie van twee homozygote individuen het fenotype van slechts één ouder zullen hebben. Het allel dat dit fenotype vastlegt wordt “dominant” genoemd, terwijl het” verborgen “allel” recessief is.”We weten nu dat dominantierelaties vaak minder duidelijk zijn, met gevallen als onvolledige dominantie, waar heterozygoten een gemengd fenotype uitdrukken; en codominantie, waar beide fenotypen worden weergegeven.
de Segregatiewet stelt dat een allel willekeurig wordt toegewezen aan elke gamete. Door te observeren dat de F2 nakomelingen van de zelfbevruchting van heterozygote F1 individuen vertoonden een 3:1 fenotypische ratio, maar dat twee van de fenotypisch dominante individuen eigenlijk heterozygoten zijn, leidde Mendel af dat de twee ouderallelen apart moeten worden geërfd. Vandaag, weten we dat segregatie optreedt tijdens meiosis, wanneer de twee homologe chromosomen van de diploïde ouder willekeurig worden verdeeld in haploïde dochtercellen, elk erven een van de twee allelen.Mendel ‘ s derde wet is de wet van het onafhankelijk assortiment, waarin staat dat individuele eigenschappen onafhankelijk worden geërfd. We weten nu dat absolute onafhankelijkheid alleen bestaat voor eigenschappen gecontroleerd door genen op afzonderlijke chromosomen in de haploïde set, die onafhankelijk worden gedistribueerd naar dochtercellen tijdens meiose. Voor twee genen op hetzelfde chromosoom, is de afstand tussen hen omgekeerd evenredig aan de waarschijnlijkheid dat zij op verschillende homologe chromosomen worden gerecombineerd, en bij uitbreiding, hoe waarschijnlijk zij samen in dezelfde nakomelingen worden geërfd. Daarom biedt het analyseren van de vier meiotische producten van een diploïde organisme een manier voor wetenschappers om de locatie van genen in kaart te brengen.
na een herziening van de principes achter genetische kruisingen, laten we eens kijken naar een protocol voor tetrad analyse.
deze techniek wordt meestal toegepast op bepaalde eencellige algen of schimmels, zoals gist, om de vier haploïde meiotische producten of sporen te ontleden, die bij deze soorten samen blijven als een “tetrad” binnen een eencellig lichaam.
om tetrad-analyse in gist uit te voeren, worden de gewenste stammen eerst geteeld op geschikte media. Gistcellen uit individuele kolonies mogen paren, bijvoorbeeld door elke stam in een kruispatroon op een nieuwe plaat te strepen. Deze plaat wordt dan replica-plated op selectieve media om alleen het diploïde product van het kruis te isoleren.
geselecteerde diploïde cellen worden gekweekt op voedingsarme media om sporulatie en tetradvorming te induceren. De asci, de structuren die de tetraden van sporen bevatten, worden verteerd in oplossingen die het enzym zymolyase bevatten. Na de spijsvertering worden individuele asci gemanipuleerd met behulp van een tetrad-dissecting microscoop. Ze zijn gerangschikt op specifieke locaties op een groeiplaat, en verstoord om de individuele sporen vrij te maken. Deze kunnen worden geplaatst in een raster-achtige patroon, waar elke spore zou genereren een individuele kolonie die verder kan worden geanalyseerd.
Nu u weet hoe tetrad-analyse wordt uitgevoerd, laten we enkele van de vele toepassingen of wijzigingen van deze techniek onderzoeken.
handmatige ontleding van tetraden is tijdrovend en onderzoekers hebben alternatieven met een hoge doorvoer ontwikkeld, zoals het rangschikken van tetraden met barcode. In deze methode, werd het diploïde nageslacht van een gistkruis getransformeerd met een bibliotheek van plasmiden, die elk een korte, unieke opeenvolging bevat die als “barcode” wordt bekend die als identifier voor elk nageslacht dienst doet. De plasmiden drukken ook GFP uit, die gist asci toestaan om via cytometry stroom worden geselecteerd en op agar-platen worden gesorteerd. De asci werden massaal op de platen gelyseerd en de sporen mochten uitgroeien tot kleine kolonies. De kolonies werden vervolgens willekeurig verdeeld over 96-wells platen voor genotypering. De unieke sequence barcode stelt onderzoekers in staat om de vier kolonies die zijn ontstaan uit sporen van elke tetrad groeperen.
genetische kruisingen kunnen ook worden gebruikt om gistcellen te genereren met grote aantallen gendeleties. In het groene Monsterproces, worden de haploïde mutantgist die verschillende gen schrappingen dragen die door GFP worden gekenmerkt gepaard en sporulated. Deze haploid Nakomelingen, waarvan sommigen deleties dragen die van beide ouders worden geërfd, worden gesorteerd via cytometry fluorescentie-geactiveerde stroom, waar de intensiteit van GFP werd getoond om met het aantal deleties huidig in een bepaalde giststam te correleren. Deze geselecteerde cellen werden toen gekweekt en opnieuw gekruist. Het herhalen van deze cyclus genereerde giststammen die talrijke schrappingen bevatten.
ten slotte zijn genetische kruisingen aangepast voor gebruik in vele modelsystemen, zoals het malaria veroorzakende intracellulaire parasiet Plasmodium. Omdat de parasiet zich alleen binnen andere cellen kan voortplanten, moeten alle kruisingen worden uitgevoerd bij muizen of muggen, respectievelijk de natuurlijke gastheer en vector van de parasiet. Hier werden muizen geïnfecteerd met twee unieke Plasmodium stammen in het bloed parasiet Stadium. De parasieten werden vervolgens overgebracht naar muggen via bloedvoeding, en eenmaal binnen rijpten ze tot gameten die zouden bevruchten om diploïde zygoten te vormen. De volwassen sporozoieten werden vervolgens geoogst van de mug en gebruikt om naïeve muizen te infecteren, waar de parasieten werden gepropageerd voor het isoleren van het kruis nakomelingen van belang.
je hebt zojuist JoVE ‘ s video over genetische kruisen bekeken. In deze video, introduceerden we de principes van overerving, hoe genetische kruisen in sommige organismen kunnen worden geanalyseerd met tetrad dissectie, en een paar huidige toepassingen. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!