Proteïnase K
geactiveerd door calcium, verteert het enzym eiwitten bij voorkeur na hydrofobe aminozuren (alifatische, aromatische en andere hydrofobe aminozuren). Hoewel calciumionen de enzymactiviteit niet beïnvloeden, dragen ze wel bij aan de stabiliteit ervan.Eiwitten worden volledig verteerd als de incubatietijd lang is en de protease concentratie hoog genoeg is. Bij verwijdering van de calciumionen wordt de stabiliteit van het enzym verminderd, maar de proteolytische activiteit blijft bestaan. Proteinase K heeft twee bindingsplaatsen voor Ca2+, die dicht bij het actieve centrum worden gevestigd, maar niet direct betrokken zijn bij het katalytische mechanisme. De restactiviteit is voldoende om eiwitten te verteren, die gewoonlijk nucleïnezuurpreparaten verontreinigen. Daarom wordt de spijsvertering met proteïnase K voor de zuivering van nucleic zuren gewoonlijk uitgevoerd in aanwezigheid van EDTA (remming van metaal-ion afhankelijke enzymen zoals nucleases).
proteïnase K is ook stabiel over een breed pH-bereik (4-12), met een pH-optimum van pH 8,0.Een verhoging van de reactietemperatuur van 37 °C tot 50-60 °C kan de activiteit meerdere malen verhogen, zoals de toevoeging van 0,5–1% natriumdodecylsulfaat (SDS) of Guanidiniumchloride (3 M), Guanidiniumthiocyanaat (1 M) en ureum (4 M). De bovengenoemde voorwaarden verbeteren proteïnase K activiteit door zijn substraatsplaatsen toegankelijker te maken. Temperaturen boven 65 °C, trichloorazijnzuur (TCA) of de serine protease-inhibitors AEBSF, PMSF of DFP remmen de activiteit. Proteïnase K zal niet worden geremd door Guanidiniumchloride, guanidiniumthiocyanaat, ureum, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citraat, jodoazijnzuur, EDTA of door andere serine proteaseremmers zoals na-Tosyl-Lys Chloormethylketon (TLCK) en na-Tosyl-Phe Chloormethylketon (TPCK).
Protease K-activiteit in veelgebruikte buffers
| Buffer (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 µg / mL protease K, 15 min incubatie) | proteïnase K activiteit (%) |
|---|---|
| 30 mm Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mm EDTA; 5% Tween-20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween-20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0.45% Tween-20; 0.5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |