Reiniging van eiwitten
de keuze van een uitgangsmateriaal is de sleutel tot het ontwerp van een zuiveringsproces. In een plant of dier wordt een bepaald eiwit meestal niet homogeen verspreid door het lichaam; verschillende organen of weefsels hebben hogere of lagere concentraties van het eiwit. Het gebruik van alleen de weefsels of organen met de hoogste concentratie vermindert de volumes die nodig zijn om een bepaalde hoeveelheid gezuiverd eiwit te produceren. Als het eiwit aanwezig is in lage overvloed, of als het een hoge waarde heeft, kunnen wetenschappers recombinant DNA-technologie gebruiken om cellen te ontwikkelen die grote hoeveelheden van het gewenste eiwit zullen produceren (Dit is bekend als een expressiesysteem). De recombinante uitdrukking staat de proteã ne toe om, b.v. door een his-markering of Strep-markering worden geëtiketteerd om zuivering te vergemakkelijken, die het aantal vereiste zuiveringsstappen verminderen.
een analytische zuivering gebruikt in het algemeen drie eigenschappen om eiwitten te scheiden. Eerst, kunnen de proteã nen volgens hun iso-elektrische punten worden gezuiverd door hen door een pH gesorteerd gel of een ionenuitwisselingskolom te lopen. Ten tweede, kunnen de proteã nen volgens hun grootte of molecuulgewicht via de chromatografie van de grootteuitsluiting of door SDS-pagina (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese) analyse worden gescheiden. De proteã nen worden vaak gezuiverd door 2D-pagina te gebruiken en worden dan geanalyseerd door peptide massa fingerprinting om de eiwitidentiteit te vestigen. Dit is zeer nuttig voor wetenschappelijke doeleinden en de opsporingslimieten voor proteã ne zijn tegenwoordig zeer laag en nanogramhoeveelheden proteã ne zijn voldoende voor hun analyse. Ten derde, kunnen de proteã nen door polariteit/hydrophobicity via hoge prestaties vloeibare chromatografie of reversed-phase chromatografie worden gescheiden.
gewoonlijk bevat een eiwitzuiveringsprotocol een of meer chromatografische stappen. De basisprocedure in chromatografie moet de oplossing die de proteã ne bevatten door een kolom stromen die met diverse materialen wordt ingepakt. De verschillende proteã nen interageren verschillend met het kolommateriaal, en kunnen zo door de tijd worden gescheiden die wordt vereist om de kolom over te gaan, of de voorwaarden worden vereist om de proteã ne uit de kolom te elute. Gewoonlijk worden de proteã nen ontdekt aangezien zij van de kolom door hun absorptie bij 280 nm komen. Er bestaan veel verschillende chromatografische methoden:
Size exclusion chromatographyEdit
chromatografie kan worden gebruikt om eiwitten in oplossing of denatureringsomstandigheden te scheiden met behulp van poreuze gels. Deze techniek is genoemd geworden chromatografie van de grootteuitsluiting. Het principe is dat kleinere moleculen een groter volume in een poreuze matrix moeten doorlopen. Consequentially, zullen de proteã nen van een bepaalde waaier in grootte een veranderlijk volume eluent (oplosmiddel) vereisen alvorens aan het andere eind van de kolom van gel wordt verzameld.
in het kader van eiwitzuivering wordt het eluent gewoonlijk in verschillende reageerbuisjes gepoold. Alle reageerbuisjes die geen meetbaar spoor van het te zuiveren eiwit bevatten, worden weggegooid. De overblijvende oplossing wordt aldus gemaakt van de te zuiveren proteã ne en om het even welke andere op gelijke grootte proteã nen.
scheiding op basis van lading of hydrofobe interactiechromatografieedit
hydrofobe interactiechromatografieedit
HIC-medium is amfifilisch, met zowel hydrofobe als hydrofiele regio ‘ s, waardoor eiwitten kunnen worden gescheiden op basis van hun oppervlaktehydrofobiciteit. Doelproteã nen en hun productsaggregate species neigen om verschillende hydrophobic eigenschappen te hebben en het verwijderen van hen via HIC verder zuivert de proteã ne van belang. Bovendien gebruikt het milieu typisch minder ruwe denaturerende voorwaarden dan andere chromatografietechnieken, waarbij het helpen om de proteã ne van belang in zijn inheemse en functionele staat te bewaren. In zuiver water, zouden de interactie tussen de hars en de hydrophobic gebieden van proteã ne zeer zwak zijn, maar deze interactie wordt verbeterd door een eiwitsteekproef aan hic hars in buffer van de hoge Ionische sterkte toe te passen. De Ionische sterkte van de buffer wordt dan verminderd om proteã nen te elute in orde van dalende hydrophobicity.
Ionenwisselchromatografiedit
Ionenwisselchromatografie scheidt verbindingen volgens de aard en de mate van hun Ionische lading. De te gebruiken kolom wordt geselecteerd op basis van het type en de sterkte van de lading. Anionuitwisselingsharsen hebben een positieve lading en worden gebruikt om negatief geladen verbindingen (anionen) te behouden en te scheiden, terwijl kationuitwisselingsharsen een negatieve lading hebben en worden gebruikt om positief geladen moleculen (kationen) te scheiden.
voordat de scheiding begint, wordt een buffer door de kolom gepompt om de tegengestelde geladen ionen in evenwicht te brengen. Op injectie van de steekproef, zullen de opgeloste molecules met de bufferionen uitwisselen aangezien elk voor de bandplaatsen op de hars concurreert. De lengte van de retentie voor elke opgeloste stof hangt af van de sterkte van de lading. De meest zwak geladen verbindingen zullen eerst elueren, gevolgd door die met achtereenvolgens sterkere ladingen. Wegens de aard van het het scheiden mechanisme, spelen pH, buffertype, bufferconcentratie, en temperatuur allen belangrijke rollen in het controleren van de scheiding.
Ionenwisselchromatografie is een zeer krachtig hulpmiddel voor gebruik bij eiwitzuivering en wordt vaak gebruikt bij zowel analytische als preparatieve scheidingen.
vrije-stroom-elektroforesedit
vrije-stroomelektroforese (ffe) is een dragervrije elektroforesetechniek die preparatieve eiwitscheiding in een laminaire bufferstroom mogelijk maakt door gebruik te maken van een orthogonaal elektrisch veld. Door gebruik te maken van een pH-gradiënt, die bijvoorbeeld door ampholytes kan worden veroorzaakt, maakt deze techniek het mogelijk om eiwitisovormen tot een resolutie van < 0,02 delta-pI te scheiden.
Affiniteitschromatografiedit
Affiniteitschromatografie is een scheidingstechniek op basis van moleculaire bouw, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van toepassingsspecifieke harsen. Deze harsen hebben ligands in bijlage aan hun oppervlakten die voor de te scheiden samenstellingen specifiek zijn. Het vaakst, functioneren deze ligands op een manier gelijkend op dat van antilichaam-antigeeninteractie. Deze” slot en zeer belangrijke ” pasvorm tussen ligand en zijn doelsamenstelling maakt het hoogst specifiek, vaak genererend één enkele piek, terwijl al anders in de steekproef unretained is.
veel membraaneiwitten zijn glycoproteïnen en kunnen worden gezuiverd door chromatografie met lectine-affiniteit. Detergent-opgeloste proteã nen kunnen worden toegestaan om aan een chromatografiehars te binden die is gewijzigd om covalent in bijlage lectine te hebben. De proteã nen die niet aan het lectine binden worden weggespoeld en dan specifiek gebonden glycoproteã NEN kunnen worden geëlueerd door een hoge concentratie van een suiker toe te voegen die met de gebonden glycoproteã nen bij de plaats van de lectineband concurreert. Sommige lectins hebben hoge affiniteit die aan oligosaccharides van glycoproteã NEN binden die moeilijk met suikers is te concurreren, en de bindende glycoproteã NEN moeten door het lectine te denatureren worden vrijgegeven.
Immunoaffiniteitschromatografieedit
Immunoaffiniteitschromatografie maakt gebruik van de specifieke binding van een antilichaam-antigeen om het doeleiwit selectief te zuiveren. De procedure impliceert het immobiliseren van een proteã Ne aan een stevig substraat (b.v. een poreuze parel of een membraan), die dan selectief het doel bindt, terwijl al het andere door stroomt. De doelproteã ne kan worden geëlueerd door pH of het zoutgehalte te veranderen. Geà mmobiliseerde ligand kan een antilichaam (zoals Immunoglobulin G) zijn of het kan een proteã ne (zoals Proteã ne A) zijn. Omdat deze methode geen techniek in een markering impliceert, kan het voor proteã nen van natuurlijke bronnen worden gebruikt.
zuivering van een gemerkt proteïne-edit
een andere manier om eiwitten te labelen is door een antigeenpeptide-label op het eiwit te monteren en vervolgens het eiwit op een kolom te zuiveren of door incubatie met een los hars dat is gecoat met een geïmmobiliseerd antilichaam. Deze bijzondere procedure staat bekend als immunoprecipitation. Immunoprecipitation kan vrij een uiterst specifieke interactie produceren die gewoonlijk in het binden slechts de gewenste proteã ne resulteert. De gezuiverde geëtiketteerde proteã nen kunnen dan gemakkelijk van de andere proteã nen in oplossing worden gescheiden en later terug in schone oplossing worden geëlueerd.
wanneer de tags niet meer nodig zijn, kunnen ze door een protease worden afgesplitst. Dit impliceert vaak engineering een protease splitsing plaats tussen de markering en de proteã ne.
Hplcedit
hogedrukvloeistofchromatografie of hogedrukvloeistofchromatografie is een vorm van chromatografie die hoge druk uitoefent om de opgeloste stoffen sneller door de kolom te drijven. Dit betekent dat de verspreiding beperkt is en de resolutie verbeterd is. De gemeenschappelijkste vorm is” omgekeerde fase ” HPLC, waar het kolommateriaal hydrophobic is. De proteã nen worden geëlueerd door een gradiënt van stijgende hoeveelheden van een organisch oplosmiddel, zoals acetonitril. De proteã nen elueren volgens hun hydrophobicity. Na zuivering door HPLC is de proteã ne in een oplossing die slechts vluchtige samenstellingen bevat, en gemakkelijk kan worden gevriesdroogd. De zuivering van HPLC resulteert vaak in denaturatie van de gezuiverde proteã nen en is dus niet van toepassing op proteã nen die niet spontaan opnieuw vouwen.