Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) en catecholoxidase (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, dat behoort tot een eiwitfamilie met het katalytische centrum gevormd door dinucleair type 3 koper, katalyseert de orthohydroxylering van monofenol en de daaropvolgende oxidatie van het difenolproduct tot het resulterende Chinon.178 een reeks reacties treedt op onder de gelijktijdige reductie van moleculaire zuurstof tot water. Het quinonproduct is een reactieve voorloper voor de synthese van melaninepigmenten. Tyrosinase, dat is opgenomen in groenten, fruit, en paddenstoelen, is een belangrijk enzym in de bruining die optreedt bij kneuzingen of langdurige opslag. Bij zoogdieren is het enzym verantwoordelijk voor huidpigmentatieafwijkingen, zoals vlekjes en defecten.179 tyrosinase is dus vrij belangrijk op het gebied van Landbouw en industrie. In de cosmetische industrie zijn de ontwikkeling en screening van krachtige remmers van tyrosinase bijzonder aantrekkelijk.
Tyrosinase wordt ingedeeld in de kopereiwitfamilie type 3, evenals catecholoxidase en het respiratoire pigment hemocyanine. Tijdens de katalytische reactie, bestaat het type-3 kopercentrum van tyrosinase in drie redoxvormen.178 de deoxy vorm (Cu–I)–Cu(I)) is een gereduceerde soort, die zuurstof bindt om de oxy vorm (Cu(II) – O22–Cu(II)) te geven. In de oxy-vorm wordt moleculaire zuurstof gebonden als peroxide in een μ-η2:η2 side-on overbruggingsmodus, die de O–O-binding destabiliseert en activeert. De met-vorm (Cu (II)–Cu(II)) wordt aangenomen als een rustgevende enzymatische vorm, waarbij Cu(II) – ionen gewoonlijk worden overbrugd met een klein ligand, zoals een watermolecuul of hydroxide-ion.
Catecholoxidase oxideert ortho-difenolen tot de overeenkomstige chinonen, maar mist mono-oxygenase-of cresolase-activiteit. Hemocyanine fungeert als een zuurstofdrager in geleedpotigen en weekdieren.
de kristalstructuren van tyrosinase uit Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 en catecholoxidase uit de zoete aardappel Ipomoea batatas180 zijn vastgesteld. Zij bevestigen dat de coördinatie van de type-3 koperplaats in tyrosinase en catecholoxidase zeer vergelijkbaar is met die in hemocyanine. Dit was eerder afgeleid uit de gelijkenis van spectroscopische eigenschappen en een vergelijking van vele tyrosinase en hemocyanine primaire structuren.181-183 op basis van de biologische bron van de proteã nen konden zeven verschillende domeinorganisaties worden geà dentificeerd. Plant catechol oxidasen van verschillende organismen hebben een sequentieidentiteit van ongeveer 40-60%. De sequentie-identiteit tussen catecholoxidasen en mulluscan hemocyanen is ongeveer 35% over bijna de gehele lengte van de sequenties. Daarentegen is de sequentieidentiteit tussen plantcatecholoxidasen en andere type-3 koperproteïnen uit elke niet-plantenbron beperkt tot de twee koperbindende gebieden.
de twee koperbindende regio ‘ s vertonen de hoogste conservering in alle kopereiwitten van het type 3. Vooral de regio bindende CuB is zeer behouden, terwijl de CuA-bindende Regio meer sequentievariatie vertoont en verantwoordelijk is gehouden voor de verschillende functies van tyrosinase, catecholoxidase en hemocyanine.
de totale structuur van tyrosinase uit S. castaneoglobisporus in complex met open leesframe ORF378 wordt weergegeven in Figuur 23. Tyrosinase neemt α-spiraalvormige structuren met de kern van het enzym, dat wordt gevormd door een vier-helix bundel. Het katalytische dinucleaire koperen centrum zit in de spiraalvormige bundel (figuur 23). Elk van de twee koperionen in een actieve locatie wordt gecoördineerd door drie zijn-residuen (figuur 24), die zijn afgeleid van de vier helices van de α-bundel, met uitzondering van Zijn54. Een koper ion (aangeduid als CuA) wordt gecoördineerd door His38, His54 en His63. His38 en His63 bevinden zich in het midden van respectievelijk α2 en α3. Het tweede koperion (CuB) wordt gecoördineerd door His190, His194 en His216. De resten His190 en His194 staan respectievelijk aan het begin en in het midden van α6, en His216 staat in het midden van α7. Dit dicopper center bevindt zich aan de onderkant van de grote holte als een vermeende substraat-bindende zak, die wordt gevormd door de hydrofobe residuen. Naast de spiraalvormige structuur heeft tyrosinase enkele β-structuren, zoals beoordeeld vanuit de ruggegraat torsiehoeken. Hierbij vormen alleen de N – en C-terminal β-strengen een plaatstructuur.
figuur 23. Lintdiagram van tyrosinase uit Streptomyces castaneoglobisporus in complex met ORF378 (PDB-code: 1WX3). Tyrosinase en ORF378 worden weergegeven in respectievelijk roze en framboos. De koperionen CuA en CuB worden afgebeeld als gele bollen; bereid met PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
figuur 24. De met-vorm van het actieve centrum van tyrosinase uit Streptomyces castaneoglobisporus( PDB-code: 1WX3); bereid met PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
hoewel de aminozuurvolgorde van tyrosinase slechts 25,3 en 26,0% identiteiten heeft met die van I. batatas catechol oxidase180 en het ODG domein van Octopus dofleini hemocyanine,184 respectievelijk, is zijn algemene structuur vrij gelijkaardig aan die van hen. Onder deze drie proteã nen, wordt een hoge graad van behoud waargenomen in het kerndomein dat uit de α-bundel wordt samengesteld. De tyrosinase en hemocyanen van Panulirus interruputus185 en L. polyfemus66 tonen geen significante homologie en geen gelijkenis in hun structuren, maar de katalytische kerndomeinen van deze proteã nen zijn superponeerbaar.
voor tyrosinase van S. castaneoglobisporus kunnen vijf verschillende toestanden van de actieve plaats worden gekarakteriseerd in kristalstructuren, namelijk kopervrije vorm, met Vorm I, met vorm II, deoxy en oxy. In kristalstructuren van catecholoxidase van I. batatas zijn de met-en deoxystoestanden evenals een inhibitor complex opgehelderd. In de met-staat (Cu (II), Cu(II)) bevinden de twee koperionen zich op een afstand van 2.9 Å, elk van hen wordt gecoördineerd door drie histidines. Ze worden overbrugd door een ander atoom, waarschijnlijk een hydroxide-ion, op een afstand van ongeveer 1,8 Å van elk koper-ion, zodat elk van hen een coördinatiegetal van 4 heeft (zie figuur 24, die dezelfde situatie voor tyrosinase van S. castaneoglobisporus laat zien). In de deoxy-of gereduceerde toestand bevinden beide koperatomen zich in de oxidatietoestand +1. De koper-koper afstand is 4.4 Å. De coördinatiegetallen zijn 4 voor CuA (drie histidine liganden en een coördinerend watermolecuul) en 3 voor CuB (drie histidine liganden). De coördinatiebol is vervormd trigonaal piramidaal voor CuA en vierkant vlak voor CuB (de coördinatieplaats bezet door de overbruggende OH− in de met-staat is vacant). In het inhibitorcomplex met fenylthioureum (PTU) neemt de koper–koperafstand toe tot 4,2 Å waarbij het zwavelatoom van PTU de hydroxobrug van de met-toestand vervangt. De coördinatiegebieden van de twee koperverbindingen blijven vergelijkbaar met die van de met-toestand, maar er zijn conformationele veranderingen bij de actieve plaatsresiduen. De belangrijkste verandering is een rotatie van de aromatische ring van Phe261 (catecholoxidasenummering).
vergeleken met de BMO-toestand hebben de coördinerende residuen in de gereduceerde toestand slechts licht verschillende posities, wat wijst op een vrij starre zak. De veranderingen in coördinatie worden geassocieerd met bewegingen van de koperatomen in de zak. Het inhibitor complex toont aan dat Phe261 zich boven de actieve plaats als een poort bevindt, die draait nadat de inhibitor is gebonden. Zo lijkt de toegang van het substraat tot het katalytische metalen Centrum te worden gecontroleerd door dit ‘poortresidu’.
het katalytische mechanisme van tyrosinase werd voor het eerst in detail bestudeerd door Solomon et al.178 Salomo stelde een mechanisme voor voor zowel de cresolase-als catecholase-activiteiten van tyrosinase (figuur 25). Dit mechanisme suggereert dat de oxy-toestand het startpunt is van cresolase-activiteit (binnenste cirkel). Deze toestand is aanwezig in de rustvorm van tyrosinase in een verhouding van ongeveer 15% (85% met-toestand). Een monofenolsubstraat bindt aan de oxy-toestand en is mono-oxygenated aan o-difenol. Dit difenol bindt vervolgens aan het kopercentrum van met-tyrosinase in een bidentaatbindingswijze die op basis van een modelverbinding wordt voorgesteld.188 oxidatie van het difenol substraat leidt tot de verminderde toestand van het dinucleaire koper centrum. Heroxidatie van de gereduceerde toestand tot de oxy toestand vindt plaats door aanval van dioxygen en sluit de katalytische cyclus.
figuur 25. Mechanisme van cresolase en catecholase activiteit van tyrosinase en catecholoxidase ontwikkeld op basis van een eerste voorstel van Solomon en collega ‘ s178 en met meer recente resultaten.186.187 overgenomen uit C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Scheikunde. 2002, 35, 183-191, met toestemming van de American Chemical Society.
het mechanisme van catecholase activiteit (buitenste cirkel) begint bij de oxy en ontmoet Staten. Een difenolsubstraat bindt zich aan de met-toestand (bijvoorbeeld), gevolgd door de oxidatie van het substraat tot het eerste Chinon en de vorming van de verminderde toestand van het enzym. De Binding van dioxygen leidt tot de oxy-toestand, die vervolgens door het tweede difenolmolecuul wordt aangevallen. Oxidatie tot het tweede Chinon vormt de voldaan toestand opnieuw en sluit de katalytische cyclus.
alternatieve reactiemechanismen omvatten een radicaal mechanisme voorgesteld door Kitajima en Morooka189 en een mechanisme waarbij een Cu(III) – tussenproduct is betrokken op basis van metingen van modelverbindingen.Op basis van de kristalstructuur van het catecholoxidase–PTU-inhibitor-complex werd een monodentaatbinding van het substraat voorgesteld voor catecholoxidase.Een radicaal mechanisme,zoals voorgesteld voor de zwakke catecholase activiteit gevonden in Octopus vulgaris hemocyanine, 191 is ook mogelijk voor catecholoxidase als gevolg van de sterke structurele relatie tussen catecholoxidase van I. batatas en odg hemocyanine zoals hierboven beschreven.
het verschil tussen catecholoxidase en tyrosinase is nog niet verklaard. Een vertragingsfase in de monofenolaseactiviteit van tyrosinase is gevonden en onderzocht en wordt verondersteld het resultaat te zijn van tijdelijke remming van de met-toestand van tyrosinase door overmaat van het monofenolsubstraat (figuur 25).186 de Monofenolaseactiviteit neemt toe wanneer het difenolproduct monofenol uit met-tyrosinase verdringt en de voortzetting van de katalytische cyclus toestaat. Catecholoxidase in zijn geïsoleerde vorm is uitsluitend aanwezig in de toestand waarin het is bereikt en wordt ook geremd door fenol. Daarom werd gesuggereerd dat het ontbreken van de oxy-toestand de reden is dat catecholoxidase geen cresolase-activiteit heeft. Aangezien Oxy catecholoxidase ook geen mono-oxygenase-activiteit vertoont, lijkt deze verklaring niet geheel bevredigend. Een andere mogelijke reden is dat de toegang tot CuA, die noodzakelijk wordt geacht voor de oxygenatie van monofenolen,192 wordt geblokkeerd in de kristalstructuur van catecholoxidase van I. batatas.