Wat is Southern Blotting?

door Hannah Simmons, M. Sc.beoordeeld door Kate Anderton, B.Sc (Editor)

Blotting is het proces waarbij DNA, RNA of eiwitten op een membraan worden overgebracht om gevisualiseerd te worden.

Credit: Paul Cowan/. com

de eerste van deze methoden was Southern Blotting, ontwikkeld in 1975 door Edward Southern, en wordt gebruikt om de sequentie van DNA-fragmenten te detecteren. Sindsdien zijn twee andere methoden ontwikkeld, genoemd noordelijke en Westelijke bevlekken. Dit zijn processen die worden gebruikt om RNA en eiwitopeenvolgingen, respectievelijk te identificeren.

methodologie van Southern blotting

DNA-fragmenten worden aanvankelijk gegenereerd met restrictie-enzymen en gescheiden door grootte in een proces dat gelelektroforese wordt genoemd. Het alkalisch wordt dan gebruikt om dubbelstrengs DNA te denatureren, die enige bundels vormen. DNA wordt dan overgebracht op een nitrocellulose of nylon blad door een membraan over het gel te plaatsen en de stroom van buffer te gebruiken om de beweging van DNA van het gel aan het membraan aan te moedigen.

capillaire stroom en vacuümoverdracht zijn de twee meest gebruikte methoden om de DNA-fragmenten over te brengen. In capillaire stroom, wordt het gel geplaatst boven het niveau van buffer op een ondersteunend blok met een membraan geplaatst bovenop. Een stapel absorberende handdoeken wordt dan geplaatst over het membraan en wordt gebruikt om de buffer van onder het gel te absorberen, die de fragmenten van DNA omhoog op het membraan opheffen.

door vacuümoverdracht wordt het membraan onder de gel geplaatst en beide worden in de buffer ondergedompeld. Een vacuüm wordt dan gebruikt om een stroom tot stand te brengen die de fragmenten van DNA neer op het membraan trekken.

verhitting of UV-straling worden dan gebruikt om ervoor te zorgen dat de DNA-fragmenten permanent aan het membraan blijven vastzitten, terwijl de specifieke opstelling van DNA behouden blijft. Single-stranded geëtiketteerde sondes worden dan gebruikt om aan doelopeenvolgingen te binden.

het blad wordt met deze sondes geïncubeerd en alleen de complementaire sondes binden. De niet-complementaire sondes worden dan gewassen uit het membraan, ervoor te zorgen dat alleen de gebonden sondes blijven. Deze sondes kunnen dan door autoradiografie worden ontdekt om het patroon van hybridisatie op een röntgenfilm te onthullen.

toepassingen van Southern blotting

Southern blotting heeft veel verschillende toepassingen. Ten eerste kunnen genherschikkingen worden geanalyseerd. Bijvoorbeeld, in immunologie kan deze methode worden gebruikt om de klonen herschikkingen van de genen van de celreceptor van T te identificeren. Ten tweede, kunnen de specifieke fragmenten van DNA van binnen een mengsel van vele andere fragmenten worden geà dentificeerd.

andere voorbeelden van toepassingen zijn zowel restriction fragment length polymorphism (RFLP) als variable number tandem repeat (VNTR) analyse. RFLP gebruikt de verschillen in lengte in homologe opeenvolgingen van DNA om genomen in kaart te brengen, en kan in gerechtelijke en vaderschapstests worden gebruikt.

de VNTR-analyse gebruikt de verschillen in lengte van herhaalde nucleotidesequenties om een DNA-vingerafdruk te vormen, een methode die algemeen wordt gebruikt in vaderschap en forensische testen.

deze methoden kunnen ook worden gebruikt voor de diagnose van ziekten veroorzaakt door mutatie, bijvoorbeeld sikkelcelanemie. Deze genetische voorwaarde is toe te schrijven aan één enkel nucleotidepolymorfisme (A aan T) in het bèta-globinegen, resulterend in abnormale hemoglobine.

Southern blotting voor fragiel X-syndroom

Southern blots zijn uitgebreid gebruikt om genen met versterkte herhalingsgebieden te helpen identificeren. Dit zijn korte, repetitieve opeenvolgingen in DNA die geen genproducten coderen. Één voorbeeld waar het zuidelijke bevlekken nuttig kan zijn is in de diagnose van breekbaar syndroom X. Deze genetische voorwaarde is toe te schrijven aan de verhoging van het CGG/ccg herhaalgebied dat binnen het gen FMR1 wordt gevestigd.

dit gen bevat gewoonlijk tussen 5-40 herhalingsgebieden. Individuen met 55-200 herhalingen hebben een FMR1-genpremutatie, en individuen met >200 herhalingen hebben fragiel X-syndroom. De toename van herhalingen leidt tot methylation van het gen, dat transcriptie remt en de productie van de FMRP-proteã ne verhindert. Deze proteã ne wordt vereist voor de normale functie van het zenuwstelsel, daarom leidt het verlies van eiwitfunctie tot de symptomen van fragiel syndroom X.

bij de diagnose worden methyleringsgevoelige restrictie-enzym EclX1 en Methyleringsongevoelige enzym EcoR1 gebruikt om de differentiatie van geméthyleerde en niet-geméthyleerde allelen mogelijk te maken. Geméthyleerde allelen worden slechts één keer gesneden om een enkelvoudig fragment van DNA van 5.1 kb te geven.

niet-gemethyleerde allelen worden echter tweemaal gesneden, wat een fragment van 2,8 kb oplevert. De niet-geméthyleerde premutatieherhalingen (< 200) kunnen daarom van geméthyleerde mutatieherhalingen van ongeveer 200 lange herhalingen worden onderscheiden, aangezien het zuidelijke bevlekken kan worden gebruikt om de grootte van de fragmenten van DNA te identificeren.

toekomstperspectieven

over het algemeen is Zuidelijke bevleking een belangrijke methode voor de diagnose en studie van ziekten (zoals het fragiele X-syndroom en sikkelcelanemie) en de analyse van DNA om andere redenen (zoals forensische en vaderschapstesten).

zuidelijk bevlekken is echter technisch zeer complex, duur en arbeidsintensief en vereist een grote hoeveelheid DNA-monster. De nieuwe methodes vervangen daarom langzaam het zuidelijke bevlekken, bijvoorbeeld real time PCR. Dit proces is veel gemakkelijker en sneller dan het zuidelijke bevlekken en vereist slechts een zeer klein volume van DNA.

verder lezen

• All Genetics Content
• Wat is genetica?
• geschiedenis van de genetica
• genetica en genexpressie
• genetische verandering

geschreven door

Hannah Simmons

Hannah is een medische en life sciences schrijver met een Master of Science (M.Sc.) diploma van Lancaster University, Verenigd Koninkrijk. Voordat hij een schrijver, Hannah ‘ s onderzoek gericht op de ontdekking van biomarkers voor de ziekte van Alzheimer en Parkinson. Ze werkte ook aan de verdere opheldering van de biologische paden die betrokken zijn bij deze ziekten. Buiten haar werk houdt Hannah van zwemmen, het nemen van haar hond voor een wandeling en het reizen van de wereld.

citaten