Czym jest Southern Blotting?

by Hannah Simmons, M. Sc.Reviewed by Kate Anderton, B.Sc. (Editor)

Blotting jest procesem, w którym DNA, RNA lub białka są przenoszone na błonę w celu wizualizacji.

kredyt: Paul Cowan/.com

pierwszą z tych metod był Southern Blotting, opracowany w 1975 roku przez Edwarda Southern i jest używany do wykrywania sekwencji fragmentów DNA. Od tego czasu opracowano dwie inne metody, zwane Northern i Western blotting. Są to procesy, które są używane do identyfikacji sekwencji RNA i białek, odpowiednio.

Metodologia Southern blotting

fragmenty DNA są początkowo generowane za pomocą enzymów restrykcyjnych i oddzielane według wielkości w procesie zwanym elektroforezą żelową. Alkaliczny jest następnie używany do denaturacji dwuniciowego DNA, tworząc pojedyncze nici. DNA jest następnie przenoszone na arkusz nitrocelulozy lub nylonu przez umieszczenie membrany nad żelem i za pomocą przepływu buforu, aby zachęcić do ruchu DNA z żelu do membrany.

przepływ kapilarny i transfer próżniowy to dwie najczęściej stosowane metody transferu fragmentów DNA. W przepływie kapilarnym żel umieszcza się powyżej poziomu bufora na bloku nośnym z membraną umieszczoną na górze. Stos chłonnych ręczników umieszcza się następnie nad membraną i służy do wchłaniania buforu spod żelu, podnosząc fragmenty DNA na membranę.

za pomocą transferu próżniowego membrana jest umieszczana pod żelem i obie są zanurzone w buforze. Następnie próżnia jest używana do tworzenia przepływu, który ściąga fragmenty DNA na membranę.

ogrzewanie lub promieniowanie UV są następnie stosowane w celu zapewnienia, że fragmenty DNA pozostają przymocowane do błony na stałe, zachowując przy tym specyficzny układ DNA. Pojedyncze znakowane sondy są następnie używane do wiązania się z sekwencjami docelowymi.

arkusz jest inkubowany z tymi sondami i wiążą się tylko sondy komplementarne. Nie uzupełniające się sondy są następnie wypłukiwane z membrany, zapewniając, że pozostają tylko związane sondy. Sondy te można następnie wykryć za pomocą autoradiografii, aby ujawnić wzór hybrydyzacji na filmie rentgenowskim.

zastosowania Southern blotting

Southern blotting ma wiele różnych zastosowań. Po pierwsze, rearanżacje genów mogą być analizowane. Na przykład w immunologii metoda ta może być stosowana do identyfikacji klonalnych rearanżacji genów receptora limfocytów T. Po drugie, konkretne fragmenty DNA można zidentyfikować z mieszaniny wielu innych fragmentów.

inne przykłady zastosowań obejmują zarówno analizę polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP), jak i analizę powtórzeń tandemowych o zmiennej liczbie (vntr). RFLP wykorzystuje różnice w długości w homologicznych sekwencjach DNA do mapowania genomów i może być stosowany w badaniach sądowych i testach na ojcostwo.

analiza VNTR wykorzystuje różnice w długości powtarzanych sekwencji nukleotydowych do utworzenia odcisku palca DNA, metody powszechnie stosowanej w badaniach ojcostwa i kryminalistyki.

metody te mogą być również stosowane w diagnostyce chorób wywołanych mutacją, na przykład niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Ten stan genetyczny jest spowodowany polimorfizmem pojedynczego nukleotydu (A do T) w genie beta-globiny, co powoduje nieprawidłowe stężenie hemoglobiny.

Southern blotting dla Fragile X syndrome

Southern blots zostały szeroko wykorzystane do identyfikacji genów z amplifikowanymi regionami powtórzeń. Są to krótkie, powtarzalne sekwencje w DNA, które nie kodują produktów genowych. Jednym z przykładów, gdzie southern blotting może być przydatny jest w diagnostyce zespołu kruchego X. Ten stan genetyczny jest spowodowany wzrostem regionu powtórzeń CGG / CCG, który znajduje się w genie FMR1.

gen ten zawiera zwykle od 5 do 40 powtórzeń. Osoby z 55-200 powtórzeniami mają premutację genu FMR1, a osoby z >200 powtórzeniami mają zespół kruchego X. Wzrost liczby powtórzeń prowadzi do metylacji genu, który hamuje transkrypcję i zapobiega produkcji białka FMRP. Białko to jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania układu nerwowego, dlatego utrata funkcji białka prowadzi do objawów zespołu kruchego X.

w diagnostyce stosuje się wrażliwy na metylację enzym restrykcyjny EclX1 i niewrażliwy na metylację enzym EcoR1, aby umożliwić różnicowanie alleli metylowanych i alleli niemetylowanych. Metylowane allele są cięte tylko raz, aby uzyskać pojedynczy fragment DNA o długości 5,1 kb.

jednak allele niemetylowane są cięte dwukrotnie, dając fragment o długości 2,8 kb. Niemetylowane powtórzenia premutacji (<200) można zatem odróżnić od metylowanych powtórzeń mutacji o długości około 200 powtórzeń, ponieważ southern blotting może być użyty do identyfikacji rozmiarów fragmentów DNA.

perspektywy na przyszłość

Ogólnie Rzecz Biorąc, Southern blotting jest ważną metodą w diagnostyce i badaniu chorób (takich jak zespół kruchego X i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa) oraz analizy DNA z innych powodów (takich jak badania sądowe i testy na ojcostwo).

jednak southern blotting jest bardzo skomplikowany technicznie, drogi, pracochłonny i wymaga dużej ilości próbki DNA. Nowe metody powoli zastępują southern blotting, na przykład real time PCR. Proces ten jest znacznie łatwiejszy i szybszy niż southern blotting i wymaga tylko bardzo małej objętości DNA.

Czytaj dalej

• Cała zawartość genetyki
• czym jest genetyka?
• Historia genetyki
• genetyka i ekspresja genów
• zmiany genetyczne

napisane przez

Hannah Simmons

Hannah jest pisarką medyczną i przyrodniczą z tytułem magistra (M.Sc.) dyplom z Lancaster University, UK. Zanim została pisarką, jej badania koncentrowały się na odkryciu biomarkerów choroby Alzheimera i Parkinsona. Pracowała również nad dalszym wyjaśnieniem szlaków biologicznych związanych z tymi chorobami. Poza pracą Hannah lubi pływać, zabierać psa na spacer i podróżować po świecie.

cytowania