Krzyże genetyczne

krzyż genetyczny to celowe kojarzenie się dwóch osobników w wyniku połączenia materiału genetycznego u potomstwa. Krzyżówki mogą być wykonywane w wielu modelowych systemach-w tym w roślinach, drożdżach, muchach i myszach—i mogą być używane do sekcji procesów genetycznych lub tworzenia organizmów o nowych cechach.

ten film omówi niektóre z zasad krzyżowania genetycznego, zbada jedną metodę wykonywania krzyżowań znaną jako analiza tetrad i omówi kilka zastosowań tej techniki.

najpierw przedstawmy podstawowe zasady dziedziczenia, które umożliwiają krzyżowanie genetyczne.

fenotyp organizmu lub skład cech zależy od jego składu genetycznego lub genotypu. W większości organizmów rozmnażających się płciowo pokolenie rodzicielskie wytwarza haploidalne komórki gamety, które mają jedną kopię każdego odrębnego chromosomu. Te następnie łączą się podczas krycia, aby wytworzyć diploidalne potomstwo z dwoma homologicznymi kopiami każdego chromosomu. Jeśli oba chromosomy zawierają ten sam allel lub odmianową formę genu, to organizm jest „homozygotyczny” w tym genetycznym locus; w przeciwnym razie jest „heterozygotyczny.”

aby rozpocząć cykl na nowo, organizm diploidalny ponownie wytwarza gamety haploidalne poprzez mejozę. Podczas tego procesu, dwa homologiczne chromosomy przechodzą „rekombinacji,” gdzie bity równoważnych sekwencji są wymieniane między parą. Proces ten tasuje rodzicielskie allele dziedziczone przez każde potomstwo, zwiększając w ten sposób ich różnorodność genetyczną.

jedną z pierwszych osób, które przeprowadziły systematyczne krzyżowania genetyczne, był „ojciec genetyki” Gregor Mendel. Wykorzystując łatwo manipulowaną roślinę grochu i badając szereg cech o spójnych wzorcach dziedziczenia, Mendel był w stanie wyprowadzić trzy podstawowe prawa dziedziczenia, które stanowiły podstawę genetyki.

pierwsze prawo Mendla to prawo jednorodności, które stwierdza, że heterozygotyczne potomstwo pierwszego, czyli F1, pokolenia dwóch homozygotycznych osobników będzie miało fenotyp tylko jednego rodzica. Allel określający ten fenotyp nazywany jest „dominującym”, podczas gdy allel „ukryty” jest ” recesywny.”Obecnie wiemy, że relacje dominacji są często mniej wyraźne, z takimi przypadkami jak niekompletna dominacja, gdzie heterozygoty wyrażają mieszany fenotyp; i kodominacja, gdzie oba fenotypy są wyświetlane.

prawo segregacji mówi, że jeden allel jest losowo przypisany do każdej gamety. Obserwując, że potomstwo F2 z samozapłodnienia osobników heterozygota F1 wykazywało 3:1 stosunek fenotypowy, ale że dwa fenotypowo dominujące osobniki są w rzeczywistości heterozygotami, Mendel wywnioskował, że dwa rodzicielskie allele muszą być dziedziczone oddzielnie. Dziś wiemy, że segregacja zachodzi podczas mejozy, kiedy dwa homologiczne chromosomy diploidalnego rodzica są podzielone losowo na haploidalne komórki potomne, z których każda dziedziczy jeden z dwóch alleli.

trzecie prawo Mendla to prawo niezależnego podziału, które stwierdza, że poszczególne cechy są dziedziczone niezależnie. Obecnie wiemy, że absolutna niezależność istnieje tylko dla cech kontrolowanych przez geny na oddzielnych chromosomach w zbiorze haploidalnym, które są niezależnie dystrybuowane do komórek potomnych podczas mejozy. W przypadku dwóch genów na tym samym chromosomie odległość między nimi jest odwrotnie proporcjonalna do prawdopodobieństwa, że są one rekombinowane na różnych chromosomach homologicznych, a co za tym idzie, jak prawdopodobne jest, że są one dziedziczone razem u tego samego potomstwa. Dlatego analiza czterech mejotycznych produktów diploidalnego organizmu umożliwia naukowcom mapowanie lokalizacji genów.

po zapoznaniu się z zasadami krzyżowania genetycznego, przyjrzyjmy się protokołowi analizy tetrad.

ta technika jest zwykle stosowana do niektórych jednokomórkowych glonów lub grzybów, takich jak drożdże, do sekcji czterech haploidalnych produktów mejotycznych lub zarodników, które u tych gatunków pozostają razem jako „tetrad” w ciele pojedynczej komórki.

aby przeprowadzić analizę tetrad w drożdżach, pożądane szczepy są najpierw hodowane na odpowiednich podłożach. Komórki drożdży z poszczególnych kolonii mogą się kojarzyć, na przykład poprzez smugi każdego szczepu w wzór krzyżowy na nowej płytce. Płytka ta jest następnie replikowana na nośnikach selektywnych, aby wyizolować tylko diploidalny produkt krzyża.

wybrane komórki diploidalne hoduje się na pożywkach ubogich w składniki odżywcze w celu wywołania zarodkowania i tworzenia się tetrad. Asci, czyli struktury utrzymujące tetrady zarodników, są trawione w roztworach zawierających enzym zymoliazę. Po trawieniu, poszczególne asci są manipulowane za pomocą mikroskopu tetrad-rozwarstwienia. Są one rozmieszczone w określonych miejscach na płytce wzrostowej i rozbijane w celu uwolnienia poszczególnych zarodników. Można je umieścić w układzie przypominającym siatkę, gdzie każdy zarodnik generowałby pojedynczą kolonię, którą można dalej analizować.

teraz, gdy wiesz, jak wykonuje się analizę tetrad, przyjrzyjmy się niektórym z wielu zastosowań lub modyfikacji tej techniki.

ręczne rozwarstwienie Tetrad jest czasochłonne, a naukowcy opracowali wysokowydajne alternatywy, takie jak sekwencjonowanie Tetrad za pomocą kodów kreskowych. W tej metodzie diploidalne potomstwo krzyżówki drożdży zostało przekształcone z biblioteką plazmidów, z których każdy zawiera krótką, unikalną sekwencję znaną jako” kod kreskowy”, który działa jako identyfikator dla każdego potomstwa. Plazmidy również wyrażają GFP, umożliwiając drożdżowe asci Wybieranie za pomocą cytometrii przepływowej i sortowanie na płytkach agarowych. Asci były masowo lizowane na płytkach, a zarodniki mogły rosnąć w małe kolonie. Kolonie zostały następnie losowo rozdzielone na 96-studzienkowe płytki do genotypowania. Unikalny kod kreskowy sekwencji pozwala naukowcom grupować cztery kolonie, które powstały z zarodników z każdej czwórki.

krzyżówki genetyczne mogą być również wykorzystywane do generowania komórek drożdży z dużą liczbą delecji genów. W procesie green monster, haploidalne zmutowane drożdże niosące różne delecje genów oznaczone przez GFP są łączone i sporulowane. Te haploidalne potomstwo, niektóre z których przenoszą delecje odziedziczone po obu rodzicach, sortuje się za pomocą aktywowanej fluorescencją cytometrii przepływowej, gdzie wykazano, że intensywność GFP koreluje z liczbą delecji obecnych w danym szczepie drożdży. Te wybrane komórki następnie hodowano i ponownie krzyżowano. Powtarzanie tego cyklu generowało szczepy drożdży zawierające liczne delecje.

wreszcie, genetyczne krzyże zostały przystosowane do stosowania w wielu systemach modelowych, takich jak powodujący malarię wewnątrzkomórkowy pasożyt Plasmodium. Ponieważ pasożyt może rozmnażać się tylko w innych komórkach, wszystkie etapy krzyżowania muszą być wykonywane u myszy lub komarów, odpowiednio naturalnego gospodarza i wektora pasożyta. Tutaj myszy zostały zainfekowane dwoma unikalnymi szczepami Plasmodium na etapie pasożytów krwi. Pasożyty były następnie przenoszone na komary poprzez karmienie krwią, a po wejściu do środka dojrzewały w gamety, które nawoziły się tworząc diploidalne zygoty. Dojrzałe sporozoity zostały następnie pobrane z komara i użyte do zarażenia naiwnych myszy, gdzie pasożyty były rozmnażane w celu izolowania interesującego krzyżowego potomstwa.

właśnie obejrzałeś filmik JoVE ’ a o genetycznych krzyżówkach. W tym filmie przedstawiliśmy zasady dziedziczenia, sposoby analizy krzyżowań genetycznych w niektórych organizmach za pomocą rozwarstwienia tetrad oraz kilka aktualnych zastosowań. Jak zawsze, dzięki za oglądanie!