Oczyszczanie białek
wybór materiału wyjściowego jest kluczem do projektowania procesu oczyszczania. W roślinie lub zwierzęciu określone białko zwykle nie jest rozprowadzane jednorodnie w całym ciele; różne narządy lub tkanki mają wyższe lub niższe stężenia białka. Zastosowanie tylko tkanek lub narządów o najwyższym stężeniu zmniejsza ilość potrzebną do wytworzenia danej ilości oczyszczonego białka. Jeśli białko jest obecne w małej obfitości lub ma wysoką wartość, naukowcy mogą wykorzystać technologię rekombinacji DNA do opracowania komórek, które będą produkować duże ilości pożądanego białka (jest to znane jako system ekspresji). Rekombinowana ekspresja umożliwia znakowanie białka, np. przez his-tag lub Strep-tag w celu ułatwienia oczyszczania, zmniejszając liczbę wymaganych etapów oczyszczania.
oczyszczanie analityczne zazwyczaj wykorzystuje trzy właściwości do oddzielania białek. Po pierwsze, białka mogą być oczyszczane zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi przez przepuszczanie ich przez żel o pH stopniowanym lub kolumnę jonowymienną. Po drugie, białka można rozdzielić w zależności od ich wielkości lub masy cząsteczkowej za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar lub za pomocą analizy SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroforesis). Białka są często oczyszczane za pomocą 2D-PAGE, a następnie analizowane przez Peptide Mass fingerprinting w celu ustalenia tożsamości białka. Jest to bardzo przydatne do celów naukowych, a granice wykrywalności białka są obecnie bardzo niskie, a nanogramowe ilości białka są wystarczające do ich analizy. Po trzecie, białka mogą być rozdzielane przez polaryzację / hydrofobowość za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub chromatografii z odwróconą fazą.
Zwykle protokół oczyszczania białka zawiera jeden lub więcej etapów chromatograficznych. Podstawową procedurą w chromatografii jest przepływ roztworu zawierającego białko przez kolumnę wypełnioną różnymi materiałami. Różne białka różnie oddziałują z materiałem kolumny, a zatem mogą być oddzielone przez czas wymagany do przejścia kolumny lub warunki wymagane do wymywania białka z kolumny. Zwykle białka są wykrywane, gdy wychodzą z kolumny przez ich absorbancję przy 280 nm. Istnieje wiele różnych metod chromatograficznych:
chromatografia wykluczająca Rozmiar edytuj
chromatografia może być stosowana do oddzielania białka w roztworze lub w Warunkach denaturacji za pomocą porowatych żeli. Technika ta jest znana jako chromatografia wykluczająca rozmiar. Zasada jest taka, że mniejsze cząsteczki muszą przemierzać większą objętość w porowatej matrycy. W konsekwencji, białka o pewnym zakresie wielkości będą wymagały zmiennej objętości eluentu (rozpuszczalnika) przed zebraniem na drugim końcu kolumny żelu.
w kontekście oczyszczania białek eluent jest zwykle gromadzony w różnych probówkach. Wszystkie probówki nie zawierające mierzalnego śladu białka do oczyszczenia są odrzucane. Pozostały roztwór składa się więc z białka do oczyszczenia i wszelkich innych białek o podobnej wielkości.
separacja w oparciu o ładunek lub hydrofobicznośćedit
chromatografia interakcji Hydrofobowejedit
HIC media to amfifilowe, z regionami zarówno hydrofobowymi, jak i hydrofilowymi, pozwalające na oddzielenie białek w oparciu o ich hydrofobowość powierzchniową. Białka docelowe i ich Agregaty produktów mają zwykle różne właściwości hydrofobowe, a usunięcie ich za pomocą HIC dodatkowo oczyszcza białko będące przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo, używane środowisko zazwyczaj wykorzystuje mniej surowe warunki denaturacji niż inne techniki chromatografii, pomagając w ten sposób zachować białko będące przedmiotem zainteresowania w jego rodzimym i funkcjonalnym stanie. W czystej wodzie interakcje między żywicą a hydrofobowymi regionami białka byłyby bardzo słabe, ale interakcja ta jest wzmocniona przez zastosowanie próbki białka do żywicy HIC w buforze o wysokiej wytrzymałości jonowej. Siła jonowa buforu jest następnie zredukowana do elucji białek w celu zmniejszenia hydrofobowości.
chromatografia Jonowymiennaedytuj
chromatografia jonowymienna oddziela związki zgodnie z naturą i stopniem ich ładunku jonowego. Kolumna, która ma być użyta, jest wybierana w zależności od jej rodzaju i siły ładunku. Żywice anionowymienne mają ładunek dodatni i są używane do zatrzymywania i oddzielania ujemnie naładowanych związków (anionów), podczas gdy żywice kationowymienne mają ładunek ujemny i są używane do oddzielania dodatnio naładowanych cząsteczek (kationów).
przed rozpoczęciem separacji bufor jest pompowany przez kolumnę w celu zrównoważenia przeciwległych naładowanych jonów. Po wstrzyknięciu próbki rozpuszczone cząsteczki wymieniają się z jonami buforowymi, ponieważ każda z nich konkuruje o miejsca wiązania na żywicy. Długość retencji dla każdej substancji rozpuszczonej zależy od siły jej ładunku. Najsłabiej naładowane związki będą najpierw eluować się, a następnie te z kolejno silniejszymi ładunkami. Ze względu na charakter mechanizmu oddzielającego, pH, Typ bufora, stężenie bufora i temperatura odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu separacji.
chromatografia jonowymienna jest bardzo silnym narzędziem do stosowania w oczyszczaniu białek i jest często stosowana zarówno w separacjach analitycznych, jak i preparatywnych.
Free-flow-electrophoresisEdit
elektroforeza swobodnego przepływu (FFE) jest techniką elektroforezy bez nośnika, która umożliwia preparatywne oddzielanie białek w laminarnym strumieniu buforowym za pomocą prostopadłego pola elektrycznego. Dzięki zastosowaniu gradientu pH, który może być na przykład indukowany przez amfolity, technika ta pozwala na oddzielenie izoform białek do rozdzielczości < 0,02 delta-pI.
chromatografia powinowactwa jest techniką rozdzielania opartą na konformacji molekularnej, która często wykorzystuje specyficzne dla aplikacji żywice. Żywice te mają ligandy przymocowane do ich powierzchni, które są specyficzne dla związków, które mają być oddzielone. Najczęściej te ligandy działają w sposób podobny do interakcji przeciwciało-antygen. To dopasowanie „zamka i klucza” między ligandem a jego docelowym Związkiem sprawia, że jest on wysoce specyficzny, często generując pojedynczy pik, podczas gdy Wszystko inne w próbce jest niezabezpieczone.
wiele białek błonowych jest glikoproteinami i można je oczyszczać metodą chromatografii powinowactwa lektynowego. Rozpuszczone w detergencie białka można pozostawić do wiązania z żywicą chromatograficzną, która została zmodyfikowana, aby miała kowalencyjnie dołączoną lektynę. Białka, które nie wiążą się z lektyną, są zmywane, a następnie specyficznie związane glikoproteiny mogą być eluowane przez dodanie wysokiego stężenia cukru, który konkuruje z powiązanymi glikoproteinami w miejscu wiązania lektyny. Niektóre lektyny mają wysokie powinowactwo do oligosacharydów glikoprotein, które trudno konkurować z cukrami, a związane glikoproteiny muszą być uwalniane przez denaturowanie lektyny.
chromatografia Immunoaffinityedytuj
chromatografia Immunoaffinity wykorzystuje specyficzne wiązanie przeciwciało-antygen do selektywnego oczyszczania białka docelowego. Procedura polega na unieruchomieniu białka do stałego podłoża (np. porowatego koralika lub membrany), które następnie selektywnie wiąże cel, podczas gdy Wszystko inne przepływa przez. Białko docelowe może być eluowane przez zmianę pH lub zasolenia. Unieruchomiony ligand może być przeciwciałem (takim jak immunoglobulina G) lub może być białkiem (takim jak białko a). Ponieważ ta metoda nie obejmuje inżynierii w znaczniku, może być stosowana do białek ze źródeł naturalnych.
Oczyszczanie oznaczonego proteinEdit
innym sposobem znakowania białek jest zaprojektowanie znacznika peptydowego antygenu na białku, a następnie oczyszczenie białka na kolumnie lub przez inkubację z luźną żywicą pokrytą unieruchomionym przeciwciałem. Ta szczególna procedura jest znana jako immunoprecypitacja. Immunoprecypitacja jest całkiem zdolna do generowania bardzo specyficznej interakcji, która zwykle skutkuje wiązaniem tylko pożądanego białka. Oczyszczone oznaczone białka mogą być łatwo oddzielone od innych białek w roztworze, a następnie eluowane z powrotem do czystego roztworu.
gdy znaczniki nie są już potrzebne, można je oddzielić za pomocą proteazy. Często wiąże się to z zaprojektowaniem miejsca rozszczepiania proteazy pomiędzy znacznikiem a białkiem.
HPLCEdit
wysokosprawna chromatografia cieczowa lub wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa to forma chromatografii z zastosowaniem wysokiego ciśnienia w celu szybszego przepchnięcia substancji rozpuszczonych przez kolumnę. Oznacza to, że dyfuzja jest ograniczona, a Rozdzielczość poprawiona. Najczęstszą formą jest” faza odwrócona ” HPLC, w której materiał kolumny jest hydrofobowy. Białka są eluowane przez gradient rosnących ilości rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl. Białka eluują się zgodnie z ich hydrofobowością. Po oczyszczeniu za pomocą HPLC białko jest w roztworze, który zawiera tylko lotne związki i może być łatwo liofilizowany. Oczyszczanie HPLC często prowadzi do denaturacji oczyszczonych białek i dlatego nie ma zastosowania do białek, które nie ulegają samoistnemu odkładaniu.