Proteinaza K

BY admin
|

aktywowana przez wapń, enzym trawi białka preferencyjnie po aminokwasach hydrofobowych (alifatycznych, aromatycznych i innych aminokwasach hydrofobowych). Chociaż jony wapnia nie wpływają na aktywność enzymu, przyczyniają się do jego stabilności.Białka zostaną całkowicie strawione, jeśli czas inkubacji jest długi, a stężenie proteazy wystarczająco wysokie. Po usunięciu jonów wapnia stabilność enzymu jest zmniejszona, ale aktywność proteolityczna pozostaje. Proteinaza K posiada dwa miejsca wiązania dla Ca2+, które znajdują się blisko centrum aktywnego, ale nie są bezpośrednio zaangażowane w mechanizm katalityczny. Aktywność resztkowa jest wystarczająca do trawienia białek, które zwykle zanieczyszczają preparaty kwasu nukleinowego. Dlatego trawienie Proteinazą K do oczyszczania kwasów nukleinowych odbywa się zwykle w obecności EDTA (hamowanie enzymów zależnych od jonów metali, takich jak nukleazy).

Proteinaza K jest również stabilna w szerokim zakresie pH (4-12), z optymalnym pH pH 8,0.Podwyższenie temperatury reakcji z 37 °C do 50-60 °C może kilkakrotnie zwiększać aktywność, jak dodanie 0,5-1% siarczanu dodecylu sodu (SDS) lub chlorku guanidyny (3 M), tiocyjanianu guanidyny (1 m) i mocznika (4 m). Wyżej wymienione Warunki zwiększają aktywność proteinazy K poprzez zwiększenie dostępności miejsc rozszczepiania jej substratu. Temperatury powyżej 65 °C, kwas trichlorooctowy (TCA) lub inhibitory proteazy serynowej aebsf, PMSF lub DFP hamują aktywność. Proteinaza K nie będzie hamowana przez chlorek guanidyny, tiocyjanian guanidyny, mocznik, Sarkozyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, cytrynian, kwas jodooctowy, EDTA ani przez inne inhibitory proteazy serynowej, takie jak keton Chlorometylowy na-Tosylo-Lys (TLCK) i keton Chlorometylowy na-Tosylo-Phe (Tpck).

aktywność proteazy K w powszechnie stosowanych buforach

Bufor (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 µg/mL proteazy K, 15 min inkubacji) aktywność proteinazy K (%)
30 mM Tris * Cl 100
30 mM Tris * Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; 800 mmHg art. 313
36 Mm Tris·Cl; 36 mm EDTA; 5% Twin 20; 0,36% Triton X-100; 735 mm GuHCl 301
10 Mm Tris·Cl; 25 mm EDTA; 100 mm NaCl; 0,5% SDS 128
10 Mm Tris·Cl; 100 mm EDTA; 20 mm NaCl; 1% Саркозил 74
10 Mm Tris·Cl; 50 mm KCl; 1,5 mm MgCl2; 0,45% Twin 20; 0,5% Triton X-100 106
10 mm Tris·Cl; 100 mm EDTA; 0.5% SDS 120
30 mm Tris * Cl; 10 mm EDTA; 1% SDS 203