Test żółciowo-Eskulinowy do przypuszczalnej identyfikacji enterokoków i paciorkowców: wpływ stężenia żółci, Technika inokulacji i czas inkubacji

rozpoznawanie i różnicowanie katalazo-ujemnych, Alfa-hemolitycznych i niehemolitycznych Gram-dodatnich kokci w parach i łańcuchach jako enterokoków; paciorkowce z grupy D (mainlyStreptococcus bovis) oraz paciorkowce z grupy viridanów bez grupy D są klinicznie ważne (10). Test żółciowo-eskulinowy jest szeroko stosowany do różnicowania enterokoków i paciorkowców grupy D, które są tolerancyjne dla żółci i mogą hydrolizować eskulinę do eskulety, od paciorkowców z grupy wirydów innych niż grupa D, które słabo rosną na żółci. Po raz pierwszy opisany w 1926 roku przez Meyera i Schonfelda (8), test żółciowo-eskulinowy został wykazany przez Facklama i Moody ’ ego (2, 3, 5) jako Czułość 100% i swoistość 97% dla identyfikacji enterokoków i paciorkowców grupy D. Wyniki te uzyskano za pomocą skosów agaru zawierających 4% oxgall (soli żółciowych), zaszczepionych 1 lub 2 kroplami 24-godzinnej hodowli Todda-Hewitta (zaszczepienie”następnego dnia”) i inkubowanych przez 48 godzin. w rutynowej bakteriologii diagnostycznej taki protokół jest niepraktyczny, ponieważ wymaga 3 dni od wykrycia kolonii na płytkach pierwotnych. Większość podręczników i podręczników procedur zaleca szczepienie skosów agaru bezpośrednio z kilku Kolonii (szczepienie” tego samego dnia”), a nie z subkultury 24-godzinnej w bulionie, ale brakuje danych potwierdzających tę niestandardową alternatywną technikę.

dlatego oceniliśmy czułość i swoistość testu żółciowo-eskulinowego za pomocą dwóch różnych metod szczepienia tego samego dnia (standaryzowanego i niestandardowego) oraz dwóch różnych czasów inkubacji (24 i 48 h). Porównaliśmy również skosy eskuliny zawierające 2 i 4% oxgall w preparatach dostępnych obecnie z dwóch głównych źródeł komercyjnych w Stanach Zjednoczonych.

Katalazo-ujemne, gram-dodatnie cocci w parach i łańcuchach tworzących kolonie Alfa-hemolityczne lub niehemolityczne na 5% agarze krwi owczej, które były dodatnie na PYR (Murex, Dartford , Wielka Brytania) i rosły w tryptycznym bulionie sojowym zawierającym 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) zostały zidentyfikowane jako enterokoki; były specjalizowane z systemem API Rapid Strep (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Katalazo-ujemne, gram-dodatnie cocci w parach i łańcuchach tworzących kolonie Alfa-hemolityczne lub niehemolityczne, które były ujemne dla PYR, nie rosły w 6,5% NaCl, były dodatnie dla antygenu grupy D przez aglutynację lateksową (Murex) i miały sugestywny (≥90% prawdopodobieństwa) wzorzec biochemiczny przez system szybkiej paciorkowców API zidentyfikowano jako S. bovis. Katalazo-ujemne, gram-dodatnie kokcy w parach i łańcuchach tworzących kolonie Alfa-hemolityczne lub niehemolityczne, które były ujemne dla antygenu PYR i grupy D (i były nierozpuszczalne w żółci, jeśli Alfa-hemolityczne), nazywane były paciorkowcami z grupy viridanów.

przebadano łącznie 110 szczepów enterokoków (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium oraz 61 szczepów niehemolitycznych i niespecyfikowanych), 30 szczepów S. bovis (2 szczepy Alfa-hemolityczne i 28 szczepów niehemolitycznych) oraz 110 szczepów paciorkowców z grupy D niehemolitycznych (83 szczepy Alfa-hemolityczne i 27 szczepów niehemolitycznych). Szczepy izolowano kolejno z posiewów krwi wykonanych w Duke University Medical Center w ciągu 4 lat, z wyjątkiem 19 s. bovisstrains, które uzyskano z Mayo Clinic.

świeże (24-h) bakterie zaszczepiono na trzech różnych skosach agaru eskuliny, które nie zawierają żółci (BDMS), 2% oxgall (co odpowiada 20% żółci) (BDMS) lub 4% oxgall (co odpowiada 40% żółci) (Remel, Lenexa, Kans.). Poza oxgallem kompozycje trzech nośników były takie same. Dla każdego podłoża zastosowano następujące dwie techniki szczepienia: (i) bezpośrednie, niestandardowe szczepienie w kształcie litery S od 1 do 10 Kolonii oraz (ii) pośrednie, standaryzowane szczepienie 10 µl (skalibrowana pętla) standardowej zawiesiny bakterii o stężeniu 0,5 McFarlanda w sterylnej wodzie dejonizowanej. Skosy inkubowano w temperaturze 35°C w otaczającym powietrzu (2) z luźnymi kapslami przez 48 godzin. odczyty pobrano w 24 i 48 godzinach. reakcję uznano za pozytywną, gdy połowa lub więcej pożywki zostało czernionych (4).

z jednym wyjątkiem, wszystkie 110 szczepów enterokoków dało wyraźne pozytywne reakcje po 24 i 48 godzinach inkubacji (czułość 99%). Standaryzowane inokulum (około 106 CFU) było tak samo czułe jak cięższe, niestandardowe inokulum. Facklam i Moody, stosując inokulum o stężeniu 107 do 108 JTK na skosach agaru, zgłaszali Czułość 100% po 48 godzinach, ale po 24 godzinach inkubacji stwierdzono, że 2 spośród 76 (5) i 6 spośród 157 (3) szczepów enterokokowych wykazuje ujemną obecność żółci-eskuliny (czułość 98%). Swan (13), używając niestandardowego inokulum opisanego jako ciężkie, jak i agarowe płytki, na których jakiekolwiek zaczernienie uznano za wynik pozytywny, uzyskał Czułość 100% W 24 h przy 121 szczepach enterokokowych. Niemniej jednak, w oparciu o publikacje Facklam, większość podręczników i podręczników procedur zaleca inkubację przez 48 godzin przed zgłoszeniem negatywnego wyniku.

wszystkie 30 szczepów S. bovis były dodatnie po 24 i 48 godzinach, niezależnie od stężenia żółci lub metody szczepienia (100% czułości). Facklam (3) wykazywał czułość odpowiednio 94 i 100% po 24 i 48 h W przypadku 37 szczepów paciorkowców grupy D.

w tabeli 1 podano odsetek fałszywie dodatnich testów na obecność żółci-eskuliny dla 110 szczepów paciorkowców spoza grupy D z grupy wirydanów. Stwierdzono, że swoistość (100% minus procent fałszywie dodatni) była maksymalna (97%) przy standaryzowanym inokulum smugowanym na skosach agaru zawierających 4% oxgall i odczytywana po 24 h. fałszywie dodatnie uzyskano z dwoma Streptococcus milleri i jednym Streptococcus lactis subsp. diacetylaktyny. Brak standaryzacji inokulum, spadek stężenia oxgall do 2% i wydłużenie czasu inkubacji do 48 h zwiększyły liczbę fałszywie dodatnich wyników do maksymalnie 24%. We wcześniejszych badaniach z selektywnym agarem eskulinowym zawierającym azydek sodu i tylko 10% żółcią, pozytywne reakcje z paciorkowcami z grupy D nie należącymi do grupy D występowały często (6, 11, 12). Nie opublikowano wcześniej danych dotyczących stosowania nośnika zawierającego 2% oxgall. Nasze wyniki sugerują, że ta koncentracja jest nieoptymalna. Używając 4% oxgall, Swan (13) znalazł dwa tolerujące żółć szczepy paciorkowców z grupy viridanów z 21 izolatów; żaden z nich jednak nie zhydrolizował eskuliny w 24 h. Facklam et al. stwierdzono specyficzność 99% po 24 h (3) i 81 (4) do 97% (3) po 48 h z 4% oxgallem.

uderzającą różnicę stwierdzono, gdy porównano podgrupy paciorkowców Alfa-hemolitycznych i niehemolitycznych bez grupy D viridanów pod względem liczby fałszywie dodatnich. Dla szczepów Alfa-hemolitycznych liczba ta wynosiła 0% po 24 h i 3% po 48 h, podczas gdy dla szczepów niehemolitycznych wynosiła 11% po 24 h i 33% po 48 h, z 4% oxgallem i standaryzowanym inokulum (P = 0,017 dla wartości 24 h; dokładny test Fishera z dwoma ogonami). Taka obserwacja nie była wcześniej zgłaszana.

dla próbek innych niż krew i miejsca normalnie sterylne, SCHEMAT BLOKOWY oparty na teście żółciowo-eskulinowym w połączeniu z tolerancją NaCl 6,5% lub obecnością PYR jest wystarczający do wiarygodnej identyfikacji enterokoków. Należy specjalizować organizmy żółciowo-eskulinowe z krwi i miejsc normalnie sterylnych. Specjacja enterokoków jest przydatna ze względów epidemiologicznych i dlatego, że E. faecium i inne gatunki są bardziej odporne na antybiotyki niż E. faecalis (8, 9). Ostateczne określenie ofS. bovis jest ważny, ponieważ organizm jest związany z rakiem okrężnicy, co należy wykluczyć u takich pacjentów (7). Z drugiej strony, fałszywie dodatnie raporty ofS. bovis może prowadzić do niepotrzebnych badań. Specjacja organizmów żółciowo-eskulinowych pozwoli również na wykrycie fałszywie dodatnich paciorkowców z grupy D bez grupy D. Błędy terapeutyczne mogą wystąpić podczas błędnej identyfikacji paciorkowców i enterokoków (1). Rutynowa specjacja organizmów żółciowo-eskulinowych-ujemnych nie jest konieczna, ponieważ enterokoki i paciorkowce z grupy D rzadko wywołują reakcje fałszywie ujemne.

podsumowując, test żółciowo-eskulinowy działa dobrze, aby szybko oddzielić enterokoki i paciorkowce z grupy D od paciorkowców z grupy D bez grupy D przy niskich kosztach i z dobrą czułością (>99%) i swoistością (97%), pod warunkiem, że jest wykonywany na skosach agaru zawierających 40% żółci, wykonywany ze standaryzowanym inokulum (10 µl standardowej zawiesiny bakteryjnej 0,5 McFarlanda) i odczytywany w ciągu 24 h.