Toksyna Clostridium difficile B

gdy katalityczna reszta treoninowa glukozylotransferazy dezaktywuje rodzinę małych Gtpaz, np. rodzinę Rho; Rac i Cdc42 wewnątrz komórek docelowych zakłócają mechanizmy transdukcji sygnału, co prowadzi do dysfunkcji cytoszkieletu aktyny, połączenia komórka-komórka i apoptozy (Fig . 5). Rho indukuje aktywność włókien stresowych aktyny. Białka Rac kontrolują aktywność falbany błonowej i NADPH-oksydazy neutrofilów. Cdc42 reguluje tworzenie włókien F-aktyny w filopodii.

Cytotoksycznośćedytuj

kilka badań wykazało, że obecność TcdB w komórkach ssaków prowadzi do szybkich zmian w morfologii komórek i sygnalizacji komórkowej. W krótkim czasie komórki mają wygląd płytki nazębnej z małymi dawkami TcdB i TcdA. Ponadto śmierć komórek jest głównym wpływem tych toksyn po odurzeniu komórek. Śledztwo prowadzone przez Donta et al., stwierdził, że TcdB ma poważny wpływ na inne komórki ssaków, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego, ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy, komórki nadnerczy myszy, hepatocyty szczurów i astrocyty szczurów (Fig.3).

aktywność cytotoksyczna opiera się na typach komórek, które mogą wahać się od 4 do 200 razy. Ogólnie rzecz biorąc, gdy komórki są zakażone TcdB, nie tylko tracą swoją integralność strukturalną, ale także zmniejszają włókna F-aktyny. Zaokrąglanie komórek za pomocą TcdB trwa nie dłużej niż 2 godziny (rys. 4), ale jeśli chodzi o śmierć komórki, może to potrwać około 24 godzin. W odniesieniu do Clostridium difficile-associated diarrhea (CDAD), skutki cytopaticzności są bardziej krytyczne niż rzeczywista śmierć komórki, ponieważ gdy komórki tracą integralność włókna aktyny cytoszkieletu, tracą również swoją normalną funkcję.

wpływ na małe GTPasesEdit

przyczyną cytotoksycznej aktywności tcdb w komórce gospodarza jest głównie endocytoza receptora. Kwaśne endosomy pozwalają toksynie B dostać się do cytozolu. Zjawisko to odbywa się przez wiążący region receptora, który umożliwia toksynie przedostanie się do komórek gospodarza. Dzięki dostępności cytozolu komórek gospodarza, TcdB dezaktywuje małe Gtpazy (Fig. 5), np. członkowie rodziny Rho Rac i Cdc42 w procesie glikozylacji treoniny 35 W Cdc42 i RAC oraz treoniny 37 w Rho. Te Rho Gtpazy znajdują się wszechobecnie w cytozolu komórek eukariotycznych, które są odpowiedzialne za organizację cytoszkieletu aktyny, ponieważ toksyny w cytozolu powodują kondensację włókien aktyny w wyniku zaokrąglenia komórek i wyblaknięcia błony (Fig. 3), co ostatecznie prowadzi do apoptozy. Tcdb powoduje krytyczne zmiany w dynamice i morfologii komórek. Rysunek 3 przedstawia prawdopodobny wpływ toksyny B na powierzchnię komórki; wyblaknięcie błony (czarne strzałki). Ponadto TcdB dezaktywuje Rho GTPases. W konsekwencji, połączenia komórkowe są zakłócone, co zwiększa przepuszczalność nabłonka toksyny B i gromadzenie się płynu w świetle. Jest to jeden z głównych czynników sprawczych w zamawianiu Clostridium difficile-associated diarrhea (CDAD) (rys. 5).

ponadto szybkość hydrolizy przez tcdb glukozy UDP jest około pięciokrotnie większa niż TcdA. Kilka badań wykazało, że Rho wykazuje modyfikację posttranslacyjną poprzez prenylację i karboksymetylację, która występuje w cytoplazmatycznej stronie błony plazmatycznej, stąd wymiana GTP na GDP. Gdy tcdb wiąże się z Rho i innymi małymi Gtpazami, GTP hydrolizuje do PKB, co prowadzi do wiązania GTP (aktywnego) do wiązania PKB (nieaktywnego) (Fig. 5). Ponadto aktywność ta jest regulowana przez czynniki guaninowe w cytozolu komórki.

zaburzenia na ścieżkach sygnałowychedytuj

komórkowa Regulacja Rho, Rac i Cdc42 ma wpływ poza sąsiedztwem włókien aktyny cytoszkieletu (rys. 4), te małe Gtpazy są włączone do cyklu komórkowego, który reguluje sygnały poprzez kinazy białkowe aktywowane mitogenem (MAPKKs). Niektóre fizjologiczne części komórek, które nie są zaangażowane w włókna aktyny, nie może powodować zaokrąglenia komórek lub śmierci komórki od razu, ale w dalszej aktywności szlaku, może prowadzić do pogorszenia włókien aktyny i wreszcie, śmierć komórki.

w 1993 roku, badanie przeprowadzone przez Shoshan et al., wykazały, że komórki z TcdB zmieniły aktywność fosfolipazy A2. Było to niezależne Zdarzenie od zakłócenia cytoszkieletu aktyny. Shoshan et al., wykazał również, że tcdb hamuje aktywność sygnałową receptora poprzez dezaktywację białek Rho za pomocą fosfolipazy D.

tworzenie Porówedit

TcdB uzyskuje dostęp do wnętrza komórki poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny, gdy Toksyna B jest częścią cytozolu, glukozylotransferaza przechodzi przez błonę endosomalną, co zmniejsza pH, indukuje translokację i ostatecznie prowadzi do zmian morfologicznych reszt regionu translokacji (958-1130). Regiony hydrofobowe są osadzone w błonie gospodarza, tworząc pory, które umożliwiają przechodzenie domen glukozylotransferazy. Kiedy komórki są zakażone TcdB w kwaśnym środowisku, łagodzi toksyny i powoduje zmiany kształtu (rys. 6). W wyniku kwaśnego pH, TcdB wykazuje wyraźne różnice w pierwotnej fluorescencji tryptofanu, wrażliwości proteaz i powierzchni hydrofobowych. Inna grupa wykazała, że zakwaszenie prowadzi do zmian konformacyjnych toksyny i, co ważniejsze, pomaga tworzyć pory. Przypuszczalny region translokacji (rys. 2) zawiera około 801-1400 aminokwasów, z których pozostałości 958-1130 są hydrofobowe i są odpowiedzialne za tworzenie porów przezbłonowych. W większości badań wykorzystano szczep tcdb 630, aby pokazać aktywność tworzenia porów toksyn C. difficile.

indukowane przez pHEdit

aby sprawdzić, czy efekty proteolitycznego rozszczepiania TcdB mają miejsce na powierzchni komórki lub w kwaśnych endosomach, w badaniach wykorzystano Bafilomycynę A1, o której wiadomo, że blokuje ATPazy H+typu V endosomów. Zmniejsza to kwasowość endosomów. Fizjologiczny szlak wychwytu tcdb zapobiega aktywności cytopatycznej TcdB. Gdy komórki znajdowały się w warunkach kwaśnych (pH 4,0) przez 5 minut po związaniu TcdB z powierzchnią komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obserwowano zmiany kształtu i zaokrąglenia. Jednakże, gdy zaokrąglone komórki inkubowano przez dodatkową godzinę w neutralnym pH (7,0) o podobnych parametrach, nie zaobserwowano zaokrąglania komórek. Oba badania wykazały, że toksyna B ma właściwość rozszczepiania proteolitycznego, co ma kluczowe znaczenie dla dostępu do cytozolu. Kwaśne pH endosomu prowadzi do zmian topologicznych TcdB (Fig.6).

GeneticsEdit

gen kodujący białko TcdB, tcdB, znajduje się w obrębie regionu chromosomalnego 19,6 kb. Jest to znane jako locus patogeniczności lub PaLoc (ryc. 2). Otwarta ramka odczytu (ORF) dla tcdb ma długość 7098 nukleotydów. Ważne jest, aby wspomnieć—że-oprócz głównych genów toksyn w regionie PaLoc-istnieją trzy inne geny pomocnicze, które kodują w regionie PaLoc: tcdr (L), TCDC (R) i tcde w środku. Geny te pomagają regulować ekspresję tcda i tcdb. Pomagają również wydzielać lub uwalniać toksyny z komórki. Kodujący Gen tcde, zlokalizowany pomiędzy tcdb i tcdA, jest analogiczny do białek holiny, dlatego sugeruje się, że tcde działa jako gen ułatwiający, który zwiększa uwalnianie lub wydzielanie TcdA i tcdb w konsekwencji zwiększając przepuszczalność błony komórkowej gospodarza.

wykrywanie Toksynyedytuj

istnieją różne rozmiary plazmidów C. difficile. Wykryte masy cząsteczkowe wahają się od 2, 7×106 do 100×106, ale rozmiary plazmidów nie wykazują korelacji z toksycznością. W celu wykrycia poziomu toksyny B W C. difficile, klinicyści intensywnie wykorzystują testy hodowli komórkowej pochodzące z próbek stolca od pacjentów z PMC. Test hodowli komórkowej jest uważany za” złoty standard ” do wykrywania toksyczności w C. difficile, ponieważ niewielka ilość toksyny B jest w stanie spowodować zaokrąglenie komórek (Fig. 4), a zatem główną zaletą laboratoriów klinicznych jest korelacja z CDAD spowodowaną przez TcdB. Chociaż aktywność cytotoksyczna dużych toksyn clostridial (LCTs) stwierdzono w próbkach PMC stolca pacjenta, aktywność toksyny B miał bardziej szkodliwe efekty cytotoksyczne w porównaniu z toksyny A. W związku z tym aktywność toksyny a jest atenuowany, gdy nie jest izolowany z toksyny B. wykrywanie toksyczności C. difficile jest niezwykle wrażliwe, jednak za pomocą testu hodowli komórkowej pozwala laboratoriom klinicznym przezwyciężyć wyzwanie; zastosowanie dawek zaledwie 1 pg/mL toksyny B wystarcza do zaokrąglenia komórek. Jest to główna zaleta w stosowaniu testu tkanki hodowlanej do wykrywania toksyczności u pacjentów z PMC. Mimo że laboratoria kliniczne próbowały użyć testu płytki mikrotitera enzymatycznego testu immunosorbentu (ELISA) i innych technik do wykrywania cytotoksycznej aktywności toksyny B w kale pacjentów z PMC, wyniki nie są tak dokładne jak te, w których stosowano testy hodowli komórkowej.

factor produkcji

dodając antybakteryjne, np. badania wykazały, że aktywność cytotoksyczna w hodowlach C. difficile wzrasta 4-8 razy. Ponadto, znając rolę antybiotyków w przyczynach PMC, wiele wcześniejszych badań koncentrowało się na skutkach produkcji toksyn przeciwdrobnoustrojowych. W rezultacie badania były w stanie stwierdzić, że subinhibitory charakter wankomycyny i penicyliny poziomy zwiększały produkcję toksyn w kulturach C. difficile. Ilości toksyn były skorelowane z wykorzystaniem pożywki dla organizmów. Inne badanie pokazało, że wysokie poziomy produkcji toksyn TcdB obserwowano w złożonych podłożach, takich jak bulion infuzyjny mózgu i serca. Wysokie poziomy toksyn były wytwarzane z izolacją wysoce zjadliwych. Natomiast niski poziom toksyn wytwarzano z izolacją słabo zjadliwych. Pokazuje to zatem, że produkcja toksyn była współregulowana. Chociaż mechanizm udziału środowiska w modulowaniu sygnałów wyrażających toksyny nie jest zrozumiały, badania in vitro wykazały, że ekspresja toksyn jest wzmacniana przez represji katabolitów i stresu, np. antybiotyków. Inne badanie wykazało, że ograniczenie biotyny w dobrze scharakteryzowanym podłożu zwiększa produkcję TcdB 64-krotnie i TcdA 35-krotnie. Zrobiono to za pomocą C. difficile i dawek biotyny tak małych, jak 0,05 nM. Kilka innych wczesnych badań argumentowało przeciwko teorii, że produkcja toksyn ma coś do czynienia ze stresem lub katabolitem represji toksyny tcda lub TcdB. Ponadto wiele badań twierdzi, że główną przyczyną różnic między innymi badaniami jest produkcja toksyn nie występująca ze wszystkimi izolatami C. difficile.