tyrozynaza
8.14.2.2.4 tyrozynaza (EC 1.14.18.1) i oksydaza katecholowa (EC 1.10.3.1)
tyrozynaza, która należy do rodziny białek o Centrum katalitycznym utworzonym przez dwujądrową miedź typu 3, katalizuje ortohydroksylację monofenolu a następnie utlenianie produktu difenolowego do otrzymanego chinonu.Seria reakcji zachodzi w wyniku równoczesnej redukcji tlenu cząsteczkowego do wody. Produkt chinonowy jest reaktywnym prekursorem do syntezy pigmentów melaniny. Tyrozynaza, która jest zawarta w warzywach, owocach i grzybach, jest kluczowym enzymem w brązowieniu, które występuje po zasinieniu lub długotrwałym przechowywaniu. U ssaków enzym jest odpowiedzialny za zaburzenia pigmentacji skóry, takie jak plamki i defekty.179 tak więc tyrozynaza jest dość znacząca w dziedzinie rolnictwa i przemysłu. W przemyśle kosmetycznym rozwój i badania przesiewowe silnych inhibitorów tyrozynazy są szczególnie atrakcyjne.
tyrozynaza jest klasyfikowana do rodziny białek miedzi typu 3, podobnie jak oksydaza katecholowa i hemocyjanina pigmentu oddechowego. Podczas reakcji katalitycznej miedziany Ośrodek tyrozynazy typu 3 występuje w trzech formach redoks.178 forma deoksy(Cu(I)–Cu (i)) jest gatunkiem zredukowanym, który wiąże tlen, dając formę oksy(Cu(II)–O22-Cu (II)). W postaci oksy, tlen cząsteczkowy jest związany jako nadtlenek w trybie mostkowania boku μ-η2:η2, który destabilizuje Wiązanie O–O i aktywuje je. Postać met (Cu(II)–cu(II)) przyjmuje się jako spoczynkową formę enzymatyczną, w której jony Cu(II) są zwykle łączone z małym ligandem, takim jak cząsteczka wody lub jon wodorotlenku.
oksydaza Katecholowa utlenia Orto-difenole do odpowiednich chinonów, ale nie ma aktywności monooksygenazy lub krezolazy. Hemocyjanina działa jako nośnik tlenu u stawonogów i mięczaków.
określono struktury krystaliczne tyrozynazy ze Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 i oksydazy katecholowej ze słodkiego ziemniaka Ipomoea batatas180. Potwierdzają one, że koordynacja miejsca miedzi typu 3 w tyrozynazie i oksydazie katecholowej jest bardzo podobna do tej występującej w hemocyjaninie. Zostało to wcześniej wywnioskowane z podobieństwa właściwości spektroskopowych i porównania wielu pierwotnych struktur tyrozynazy i hemocyjaniny.181-183 na podstawie biologicznego źródła białek można było zidentyfikować siedem różnych organizacji domenowych. Oksydazy katecholowe roślinne różnych organizmów mają identyczność sekwencyjną około 40-60%. Identyczność sekwencji między oksydazami katecholowymi a hemocyjaninami mulluscan wynosi około 35% na prawie całej długości sekwencji. Natomiast identyczność sekwencji między roślinnymi oksydazami katecholowymi a innymi białkami Miedziowymi typu 3 z dowolnego źródła nieplantowego jest ograniczona do dwóch regionów wiążących miedź.
dwa regiony wiążące miedź wykazują najwyższą ochronę we wszystkich białkach miedzi typu 3. Szczególnie Region wiążący szczenię jest silnie zachowany, podczas gdy Region wiążący CuA wykazuje większą różnorodność sekwencji i jest odpowiedzialny za różne funkcje tyrozynazy, oksydazy katecholowej i hemocyjaniny.
ogólna struktura tyrozynazy z S. castaneoglobisporus w kompleksie z otwartą ramką odczytu ORF378 przedstawiono na fig. 23. Tyrozynaza przyjmuje struktury α-spiralne z rdzeniem enzymu, które tworzy wiązka czterech Helis. Katalityczne dwujądrowe centrum miedzi jest osadzone w wiązce spiralnej (Fig. 23). Każdy z dwóch jonów miedzi w miejscu aktywnym jest koordynowany przez trzy reszty His (Fig. 24), które pochodzą z czterech Helis wiązki α, z wyjątkiem His54. Jeden jon miedzi (oznaczony CuA) jest koordynowany przez His38, His54 i His63. His38 i his63 znajdują się odpowiednio w środku α2 i α3. Drugi jon miedzi (CuB) jest koordynowany przez His190, His194 i His216. Pozostałości His190 i His194 znajdują się odpowiednio na początku i w środku α6, a His216 znajduje się w środku α7. To centrum dicopper znajduje się na dnie dużej wklęsłości jako przypuszczalna kieszeń wiążąca podłoże, która jest utworzona przez pozostałości hydrofobowe. Oprócz struktury spiralnej, tyrozynaza ma kilka struktur β, ocenianych na podstawie kątów skrętu kręgosłupa. W nich tylko N-I C-końcowe nici β tworzą strukturę arkusza.
rysunek 23. Schemat wstęgowy tyrozynazy ze Streptomyces castaneoglobisporus w kompleksie z ORF378 (kod PDB: 1WX3). Tyrozynaza i ORF378 są pokazane odpowiednio w kolorze różowym i malinowym. Jony miedzi CuA i CuB są przedstawione jako żółte kule; przygotowane z Pymolem (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
rysunek 24. Met forma aktywnego centrum tyrozynazy ze Streptomyces castaneoglobisporus (kod PDB: 1wx3); przygotowana z Pymolem (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
chociaż Sekwencja aminokwasowa tyrozynazy ma tylko 25,3 i 26,0% tożsamości z oksydazą katecholową I. batatas180 i domeną ODG Hemocyjaniny ośmiornicy Dofleini,184, jej ogólna struktura jest dość podobna do ich. Wśród tych trzech białek obserwuje się wysoki stopień zachowania w domenie rdzenia złożonej z wiązki α. Tyrozynaza i hemocyjaniny z przerwania Panuliru185 i L. polifem66 nie wykazuje znaczącej homologii ani podobieństwa w swoich strukturach, ale katalityczne domeny rdzeniowe tych białek są nakładalne.
dla tyrozynazy z S. castaneoglobisporus w strukturach krystalicznych można scharakteryzować pięć różnych stanów miejsca aktywnego, a mianowicie formę bez miedzi, formę met I, formę met II, deoksy i oksy. W strukturach krystalicznych oksydazy katecholowej z I. batatas zostały wyjaśnione Stany met I deoksy oraz kompleks inhibitorów. W stanie met(Cu(II), Cu (II)) dwa jony miedziowe znajdują się w odległości 2.9 Å, każdy z nich jest koordynowany przez trzy histydines. Są one mostkowane przez inny atom, najprawdopodobniej jon wodorotlenkowy, w odległości około 1,8 Å od każdego jonu miedziowego, tak że każdy z nich ma liczbę koordynacyjną 4 (patrz rysunek 24, który pokazuje tę samą sytuację dla tyrozynazy z S. castaneoglobisporus). W stanie deoksylacji lub redukcji oba Atomy miedzi znajdują się w stanie utleniania +1. Odległość Miedź-Miedź wynosi 4,4 Å. Liczba koordynacyjna wynosi 4 dla CuA (trzy ligandy histydyny i koordynująca cząsteczka wody) i 3 dla CuB (trzy ligandy histydyny). Sfera koordynacyjna jest zniekształcona trygonalnie piramidalna dla CuA i kwadratowa planarna dla CuB (miejsce koordynacji zajmowane przez mostek OH− w stanie met jest wolne). W kompleksie inhibitorów z fenylotiomocznikiem (PTU) odległość Miedź–Miedź wzrasta do 4,2 Å, a atom siarki Ptu zastępuje mostek hydroksylowy stanu met. Sfery koordynacyjne obu copperów pozostają podobne do tych ze stanu met, ale w miejscu aktywnym występują zmiany konformacyjne. Najistotniejszą zmianą jest rotacja pierścienia aromatycznego Phe261 (numeracja oksydazy katecholowej).
w porównaniu ze stanem met, pozostałości koordynacyjne mają tylko nieco inne pozycje w stanie zredukowanym, co wskazuje na raczej sztywną kieszeń. Zmiany w koordynacji są związane z ruchami atomów miedzi w kieszeni. Kompleks inhibitora pokazuje, że Phe261 znajduje się nad miejscem aktywnym jak brama, która obraca się po związaniu inhibitora. Tak więc dostęp substratu do katalitycznego centrum metalu wydaje się być kontrolowany przez tę „pozostałość bramkową”.
mechanizm katalityczny tyrozynazy został po raz pierwszy szczegółowo zbadany przez Solomona i wsp.178 Salomon zaproponował mechanizm zarówno dla aktywności krezolazy, jak i katecholazy tyrozynazy (ryc. 25). Mechanizm ten sugeruje, że stan oksy jest punktem wyjścia aktywności krezolazy (kręgu wewnętrznego). Stan ten występuje w postaci spoczynkowej tyrozynazy w proporcji około 15% (85% stanu met). Substrat monofenolowy wiąże się ze stanem oksy i jest monooksygenowany z o-difenolem. Difenol ten wiąże się następnie z centrum miedzi tyrozynazy met w trybie wiązania bidentatu zaproponowanym na podstawie związku modelowego.188 utlenianie substratu difenolowego prowadzi do zmniejszenia stanu dwujądrowego centrum miedzi. Reoksydacja stanu zredukowanego do stanu oksygenu następuje w wyniku ataku dioksygenu i zamyka cykl katalityczny.
rysunek 25. Mechanizm aktywności krezolazy i katecholazy tyrozynazy i oksydazy katecholowej opracowany na podstawie wstępnej propozycji Solomona i współpracowników 178, z uwzględnieniem nowszych wyników.186,187 reprodukowane z C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, za zgodą American Chemical Society.
mechanizm aktywności katecholazy (koła zewnętrznego) rozpoczyna się od Stanów oksy I met. Substrat difenolowy wiąże się ze stanem met (na przykład), po czym następuje utlenianie substratu do pierwszego chinonu i tworzenie obniżonego stanu enzymu. Wiązanie dioksygenu prowadzi do stanu oksy, który jest następnie atakowany przez drugą cząsteczkę difenolu. Utlenianie drugiego chinonu ponownie tworzy stan met i zamyka cykl katalityczny.
alternatywne mechanizmy reakcji obejmują mechanizm radykalny zaproponowany przez Kitajimę i Morooka189 oraz mechanizm obejmujący związek pośredni Cu (III) oparty na pomiarach związków modelowych.190 na podstawie struktury krystalicznej kompleksu oksydazy katecholowej–inhibitora PTU zaproponowano Wiązanie monodentatowe substratu dla oksydazy katecholowej.180 radykalny mechanizm, zaproponowany dla słabej aktywności katecholazy występującej w Hemocyjaninie Octopus vulgaris, 191 jest również możliwy dla oksydazy katecholowej ze względu na silny związek strukturalny między oksydazą katecholową z I. batatas a hemocyjaniną ODG, jak opisano powyżej.
wyraźna różnica między oksydazą katecholową a tyrozynazą nie została jeszcze wyjaśniona. Stwierdzono i zbadano fazę lag w aktywności monofenolazy tyrozynazy i proponuje się, że jest ona wynikiem czasowego hamowania stanu met tyrozynazy przez nadmiar substratu monofenolu (Fig. 25).Aktywność Monofenolazy wzrasta, gdy produkt difenolowy wypiera monofenol z met-tyrozynazy i umożliwia kontynuację Cyklu katalitycznego. Oksydaza katecholowa w wyizolowanej postaci występuje wyłącznie w stanie met i jest również hamowana przez fenol. Sugerowano zatem, że brak stanu oksy jest przyczyną braku aktywności oksydazy katecholowej. Ponieważ oksydaza oksykatecholowa również nie wykazuje aktywności monooksygenazy, Wyjaśnienie to nie wydaje się całkowicie satysfakcjonujące. Innym możliwym powodem jest to, że dostęp do CuA,który został zaproponowany jako niezbędny do utlenienia monofenoli, 192 jest zablokowany w strukturze krystalicznej oksydazy katecholowej z I. batatas.