ustanowienie konkurencyjnego testu wiązania identyfikującego różne cechy epitopów neutralizujących wirusa zapalenia wątroby typu E

Streszczenie

cel: potwierdzenie różnych cech specyficznych dla genotypu i wspólnych epitopów neutralizujących wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV). Metody: Ustalono kompetycyjny test wiązania ze znanymi przeciwciałami monoklonalnymi o wspólnym genotypie (mAbs) 3G1 i 5G5 oraz swoistymi dla genotypu neutralizującymi mAbs 2B1 i 4C5. Rekombinowane P166W01 HEV ORF2 pochodzące od genotypu 1 i p166chn pochodzące od genotypu 4 zostały użyte jako powlekane antygeny w celu określenia, czy MAB rozpoznają niezależne, podobne lub nakładające się epitopy. MAB produkowano, oczyszczano i sprzężono z peroksydazą chrzanową (HRP). Sprzężony z HRP 2B1 mógł reagować tylko z p166W01, ale nie z p166Chn, sprzężony z HRP 4C5 mógł reagować tylko z p166Chn, ale nie z p166W01, podczas gdy sprzężony z HRP 3G1 i 5G5 mógł reagować zarówno z p166W01, jak i p166Chn. Tak więc, kompetycyjne testy wiązania były sukcesywnie wykonywane przy użyciu antygenu p166W01 i p166chn. Wyniki i wnioski: wyniki testów wiązania kompetycyjnego wykazały, że Wiązanie sprzężonego 2B1 z P166W01 przez HRP nie może być hamowane przez 5G5 lub 3G1. Podobnie Wiązanie sprzężonej z HRP 4C5 z p166Chn nie mogło być hamowane przez 5G5 lub 3G1. Jednakże, MAB 5G5 i 3G1 blokowały wzajemne Wiązanie się z p166W01 i p166Chn, co sugeruje, że wspólne i specyficzne dla genotypu neutralizujące MAB rozpoznają niezależne epitopy.

© 2018 S. Karger AG, Bazylea

wprowadzenie

wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest nieuszkodzonym wirusem RNA o dodatniej nici, który jest przenoszony głównie drogą doustną i powoduje ostre wirusowe zapalenie wątroby typu E. Zakażenie wirusem HEV może prowadzić do niekorzystnych czynników prognostycznych, na przykład niewydolności życiowej, ciężkiego ostrego zapalenia wątroby, przewlekłego zakażenia narządów przeszczepionych i u pacjentów z immunosupresją oraz wysokiej śmiertelności u kobiet w ciąży . Oprócz potwierdzonego zakażenia u ludzi, wirusowe zapalenie wątroby typu E infekuje również zwierzęta i może być przenoszone ze zwierząt na ludzi; częstość występowania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu E w krajach rozwiniętych również znacznie wzrosła . Wyniki te wskazują, że HEV stanowi zagrożenie dla zdrowia publicznego na całym świecie .

chociaż rozpoznano jeden serotyp, Izolaty HEV, pochodzące z różnych obszarów na całym świecie, można podzielić na 4 główne genotypy . Hev genotypów 1 i 2 różnią się od genotypów 3 i 4 pod względem epidemiologicznym, antygenowym i immunogennym .

do tej pory badania nad charakteryzacją epitopów antygenowych głównie w oparciu o białko strukturalne HEV dla systemu hodowli in vitro są niedostępne . pORF2 jest głównym białkiem strukturalnym HEV kodowanym przez ORF2, które jest 1 z 3 nakładających się otwartych ramek odczytu (ORF) genomu wirusa . Dominujące regiony immunogenne pORF2 zlokalizowano w regionie C-terminal 2/3, które były głównymi celami rozwoju szczepionki .

nasze poprzednie badanie wykazało istnienie różnicy immunogenności między szczepionką przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu E p179 (439-617 aminokwasów białka ORF2) pochodzącą z genotypu 4 i p239 (Hekolina) pochodzącą z genotypu 1, różnicę można przypisać obecności epitopu(epitopów) specyficznego dla genotypu HEV . Przeciwciała monoklonalne (mAbs) wytwarzane u myszy immunizowanych odpowiednio p166Sar(452-617 aminokwasów białka ORF2) pochodzących z genotypu 1 i p166chn pochodzących z genotypu 4 zostały użyte do potwierdzenia obecności epitopu (- ów) specyficznego (- ych) dla ge. Oprócz 2 genotypowych neutralizujących MAB, 3G1 i 5G5, uzyskano również 2 genotypowe neutralizujące MAB, 2B1 i 4C5. 2B1 przeciwko p166Sar może specyficznie wiązać się z rekombinowanymi białkami genotypów 1 i 2 i neutralizować tylko szczepy genotypów 1 i 2 in vitro; 4C5 przeciwko p166Chn immunoreaktowano swoiście przeciwko genotypom 3 i 4 rekombinowanych białek i zneutralizowano tylko szczepy genotypu 3 i 4, podczas gdy 3G1 przeciwko p166Sar i 5G5 przeciwko p166Chn może wiązać się z genotypami 1-4 rekombinowanych białek i zneutralizowanymi szczepami genotypu 4 . W celu dalszego badania różnych właściwości epitopów neutralizujących HEV genotypu pospolitego i specyficznego dla genotypu, opracowano test wiązania konkurencyjnego z użyciem MAB 2B1, 3G1, 4C5 i 5G5, aby potwierdzić, czy epitopy rozpoznawane przez MAB są niezależne, podobne lub nakładające się.

materiały i metody

rekombinowane białka

rekombinowane p166 było ściętym białkiem pORF2, sekwencje nukleotydowe pochodziły z następujących szczepów HEV: W01 (genotyp 1, JX857689) i China-9829 (genotyp 4, AY789225). Rekombinowane plazmidy były konstruowane i ulegały ekspresji w Escherichia coli . 2 oznaczane przez His białka p166 oznaczano odpowiednio jako p166W01 i p166Chn.

produkcja mAb

do opracowania testu ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay) użyto łącznie 4 neutralizujących MAB, 2B1, 3G1, 4C5 i 5G5 opisanych wcześniej. 2B1 i 3G1 zostały podniesione przeciwko p166Sar; 4C5 i 5G5 zostały podniesione przeciwko p166Chn . MAB wytworzono przez wstrzyknięcie 106 komórek hybrydomy do jamy otrzewnowej myszy BALB/c; płyn wodobrzusza zawierający MAB zebrano po 7-10 dniach, przesączono, odwirowano i przechowywano w temperaturze -80°C.

Oczyszczanie MAB

płyn wodobrzusza MAB oczyszczano stosując chromatografię powinowactwa kolumnowego białka G-sepharose (Sigma, Niemcy). Frakcje zawierające przeciwciało zebrano za pomocą kwaśnego buforu elucyjnego (0,1 m glicyny-HCl, pH 2,8) z unieruchomionego białka G, a następnie oznaczono przy 280 nm; absorbancję przy 280 nm (A280) można wykorzystać do przybliżonego określenia ilościowego MAB. W celu potwierdzenia i oznaczenia ilościowego oczyszczonych frakcji z użyciem albuminy surowicy bydlęcej zastosowano elektroforezę w żelu poliakrylamidowym siarczanu dodecylu sodu .

łączenie peroksydazy chrzanowej z MAB

oczyszczone MAB poddano dializie wobec 100 mM buforu węglanowo-wodorowęglanowego (pH 9,3) w 4°C przez noc . Przeciwciała sprzęgano z peroksydazą chrzanową (HRP) według instrukcji producenta (KPL). Około 1,5 mg HRP zmieszano z 0,5 mg mAb w 0,5 mL całkowitej objętości buforu sprzęgającego HRP, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 15 minut po dodaniu 10 µl środka redukującego, a następnie dodano 1 objętość destylowanego glicerolu do przechowywania i dalszego użycia.

reaktywność krzyżowa sprzężonych z HRP MAB na heterologiczny antygen p166

w celu potwierdzenia reaktywności krzyżowej sprzężonych z HRP MAB z antygenem p166W01 i p166chn zastosowano metodę ELISA. Krótko mówiąc, studzienki mikropłytek pokryto odpowiednio 100 ng antygenu p166W01 i p166chn, inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. następnie usunięto powlekane antygeny; do studzienek dodano 200 µL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, a następnie mikropłytki inkubowano w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem. Dwie godziny później bufor blokujący odrzucono, a studzienki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym 0,05% Tween-20 (Pbst). W odpowiednich studzienkach dodano szeregowe 2-krotne rozcieńczenia sprzężonych z HRP MAB w zakresie od 1: 400 do 1: 25 600 W 1% kazeinie PBS, a następnie 45 minut inkubacji w temperaturze 37°C; kazeinę PBS usunięto przez przemywanie 5 razy PBST. Płynny substrat tetrametylobenzydyny dodano w celu rozwoju koloru do inkubacji w temperaturze 37°C przez 10 minut. Wreszcie, gęstość optyczną (OD) każdej studzienki odczytano przy 450 nm, przy długości fali odniesienia 630 nm.

oznaczanie miana antygenu i MAB

miana antygenu i MAB oznaczano za pomocą testu ELISA. Początkowo wytwarzano szeregowe 2-krotne rozcieńczenia sprzężonych z HRP MAB w zakresie od 1: 400 do 1: 25 600 W 1% kazeinie PBS, a następnie dodawano do studzienek wstępnie pokrytych szeregowymi rozcieńczeniami antygenu p166W01 lub p166chn. Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze 37°C, niezwiązane MAB usunięto przez 5-krotne przemywanie PBST. Dodano ciekły substrat tetrametylobenzydyny w celu rozwoju koloru przez 10-minutową inkubację w temperaturze 37°C. Wreszcie, OD każdej studzienki odczytano przy 450 nm, z długością fali odniesienia 630 nm, aby określić rozcieńczenie, które było przesycone i dało odczyt OD około 1,0 przy 450 nm, z długością fali odniesienia 630 nm.

Test wiązania Kompetycyjnego

różne cechy wspólnych i specyficznych dla genotypu epitopów neutralizujących HEV badano stosując parowy test wiązania kompetycyjnego ustalony z normalnym i specyficznym dla genotypu neutralizującym MAB . Metody były podobne do procedur opisanych powyżej, z tą różnicą, że p166W01 i p166Chn stosowano odpowiednio jako antygen powlekający, a mieszaniny sprzężonego z HRP MAB o dwukrotnym stężeniu i nasyconym stężeniu niezwiązanego mAb dodawano do powlekanych studzienek. OD mierzono przy 450 nm, przy długości fali odniesienia 630 nm. Procentową inhibicję obliczono według wzoru: 100 × . Konkurencja została oceniona jako pozytywna, jeśli odsetek hamowania wynosił więcej niż 50%.

wyniki

reaktywność krzyżowa MAB sprzężonych z HRP na heterologiczny antygen p166

do oceny reaktywności krzyżowej MAB sprzężonych z HRP na antygeny p166W01 i p166chn zastosowano metodę ELISA. Wyniki wykazały, że sprzężony z HRP 2B1 przy rozcieńczeniach od 1: 400 do 1: 25,600 reagował tylko z p166W01, ale nie z p166Chn, a sprzężony z HRP 4C5 przy rozcieńczeniach od 1: 400 do 1: 25,600 reagował tylko z p166Chn. Natomiast sprzężone z HRP 3G1 i 5G5 w rozcieńczeniach od 1: 400 do 1: 25 600 dobrze reagowały z 2 białkami p166 (Fig. 1). Obserwacje te były podobne do wcześniejszych ustaleń, 2B1 i 4C5 to specyficzne dla genotypu MAB, podczas gdy 3G1 i 5G5 to typowe dla genotypu MAB .

oznaczanie antygenu p166W01 i miana MAB sprzężonego z HRP dla testu wiązania Kompetycyjnego

antygenu p166W01 wykorzystano do ustalenia testu wiązania kompetycyjnego MAB 2B1, 3G1 i 5G5; właściwe miana MAB i antygenu oznaczono za pomocą testu ELISA. Jak pokazano w tabeli 1, po miareczkowaniu kwadratowym, gdy rozcieńczenie antygenu p166W01 wynosiło 1: 400, 2B1 sprzężone z HRP wynosiło 1: 6400, Średnia wartość OD była bliska 1,0. Tymczasem, jak pokazano w tabeli 2, gdy rozcieńczenie antygenu wynosiło 1: 400, sprzężone z HRP 5G5 i sprzężone z HRP 3G1 wynosiły odpowiednio 1: 6 400 i 1: 12 800, A Średnia wartość OD była bliska 1,0.

oznaczanie antygenu p166Chn i miana mAb sprzężonego z HRP dla testu wiązania Kompetycyjnego

antygenu p166Chn wykorzystano do ustalenia testu wiązania kompetycyjnego MAB 4C5, 3G1 i 5G5, właściwe miana MAB i antygenu oznaczono również za pomocą testu ELISA. Jak pokazano w tabeli 3, po miareczkowaniu kwadratowym, gdy rozcieńczenie antygenu p166Chn wynosiło 1: 800, sprzężony z HRP 4C5 wynosił 1: 6 400, a średnia wartość OD była bliska 1,0. Tymczasem, jak pokazano w tabeli 4, gdy rozcieńczenie antygenu wynosiło 1: 800, rozcieńczenia 5G5 sprzężonego z HRP i 3G1 sprzężonego z HRP wynosiły odpowiednio 1: 6 400 i 1: 12 800; Średnia wartość OD była bliska 1,0.

hamowanie wiązania MAB z p166W01

wyniki hamowania przedstawiono w tabeli 5; Wiązanie sprzężonego z HRP antygenu 2B1 z antygenem p166W01 zostało zahamowane przez niezwiązany 2B1 z 68% hamowaniem. Nie stwierdzono istotnego hamowania 2B1 w przypadku MAB 5G5 i 3G1 (27 i 30%). Bardziej całkowite zahamowanie uzyskano z heterologicznych MAB 3G1 i 5G5, ponieważ Wiązanie HRP-3G1 z antygenem zostało zahamowane przez 5G5 z 61% hamowaniem, sprzężone z HRP 5G5 z antygenem zostało zahamowane przez 3G1 z 99% hamowaniem. Wiązanie HRP-3G1 i HRP-5G5 z antygenem p166W01 było również prawie całkowicie hamowane przez siebie (hamowanie 81 i 80%). Wyniki te sugerują, że 3G1 i 5G5 mogą współdzielić ten sam epitop lub nakładający się epitop, jednak 2B1 prawdopodobnie rozpoznaje inny epitop.

hamowanie wiązania MAB z p166Chn

wyniki hamowania przedstawiono w tabeli 5: Wiązanie HRP-4C5 z p166Chn było hamowane przez niezwiązany 4C5 z 69% hamowaniem, nie było znaczącego hamowania (25 i 30%) uzyskanego z pozostałych 2 niezwiązanych MAB 3G1 i 4C5. Jednak wyższy wskaźnik hamowania uzyskano dzięki sprzężonym z HRP wiązaniom MAB 3G1 i 5G5 z antygenem, hamowanym przez niezwiązane 5G5 i 3G1 z 65 i 76% hamowaniem. Wiązanie sprzężonych z HRP 3G1 i 5G5 sprzężonych z HRP z antygenem p166Chn było również prawie samo w sobie hamowane. Wyniki te sugerują również, że 3G1 i 5G5 mogą współdzielić ten sam epitop lub nakładający się epitop, podczas gdy 4C5 prawdopodobnie rozpoznaje inny epitop.

dyskusja

od czasu , gdy po raz pierwszy wyizolowano nowy świński wirus HEV, donoszono o występowaniu przeciwciał anty-HEV u wielu zwierząt, ujawniono zakażenie HEV wśród zwierząt i ludzi, co może być przenoszone ze zwierząt na ludzi . Zmniejszenie zachorowalności i śmiertelności na wirusowe zapalenie wątroby typu E zależało od zapobiegania szczepieniu i skutecznej diagnostyki. Znajomość epitopów HEV była niezbędna do przygotowania szczepionki i rozwoju diagnostycznego. Wykrywanie swoistych przeciwciał w surowicy jest jedną z głównych metod diagnostycznych i rośnie liczba testów serologicznych do wykrywania przeciwciał. Jednakże testy stosowane do wykrywania specyficznych przeciwciał różnią się znacznie pod względem czułości . Niektóre komercyjne testy diagnostyczne oparte na antygenach genotypu 1 lub 2 nie wykrywają przeciwciał w surowicy przeciwko izolatom genotypu 3 lub 4 . Niewiele wiadomo o mechanizmach leżących u podstaw braku odpowiedzialności różnych testów diagnostycznych.

obecnie system hodowli komórek in vitro jest nadal niedostępny do badań HEV. Dlatego pORF2 zawierający większość miejsc immunogennych jest szeroko stosowany w badaniach immunologicznych HEV, o charakterze zależnym od konformacji . Podstawą strukturalną immunogenu do wywoływania przeciwciał neutralizujących i ochronnych jest epitop neutralizujący, który jest głównym celem rozwoju szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu E. Wcześniej informowaliśmy, że białko P166, obcięte białko pORF2, może modelować epitop neutralizujący HEV, a przeciwciała podniesione przeciwko p166 mogą neutralizować krzyżowo różne genotypy HEV . Ponadto szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu E P239 pochodząca od genotypu 1 HEV była skuteczna w badaniu klinicznym fazy 3 przeprowadzonym w prowincji Jiangsu w Chinach, gdzie epidemicznym izolatem HEV jest genotyp 4 . Odkrycia te wykazały, że wspólne epitopy neutralizujące istnieją w różnych genotypach HEV. Oprócz wspólnego epitopu neutralizującego(s), potwierdzono również istnienie epitopu(s) o genotypie-spe w celu przygotowania i charakteryzacji mAb .

w celu dalszej identyfikacji charakterystyki wspólnych i specyficznych dla genotypu epitopów neutralizujących, ustalono test hamowania kompetycyjnego z użyciem wspólnych neutralizujących MAB, 3G1 i 5G5 oraz specyficznych dla genotypu neutralizujących MAB, 2B1 i 4C5, w celu zbadania wiązania konkurencji z antygenem p166w01 lub p166chn i określenia, czy MAB rozpoznają niezależne, podobne lub nakładające się epitopy.

początkowo wytwarzano, oczyszczano i sprzężono płyny ascytyczne MAB 3G1, 2B1, 5G5 i 4C5. Zastosowano metodę ELISA w celu porównania końcowości wiązania Af sprzężonych z HRP MAB z różnymi genotypami HEV p166. Wyniki wykazały, że koniugat HRP ed 2B1 reagował tylko z genotypem 1 p166W01, ale nie p166Chn. Podobnie, sprzężona z HRP 4C5 reagowała tylko z p166Chn. Natomiast sprzężone z HRP 3G1 i 5G5 dobrze reagowały z białkami p166 o genotypie 2. Tak więc, testy wiązania kompetycyjnego są oparte na antygenach HEV P166 genotypu 1 i 4. Wyniki konkurencyjnych testów wiążących nie są zaskakujące, tj. że Wiązanie 2B1 do p166W01 konkurowało tylko samo, podczas gdy 3G1 i 5G5 mogły konkurować ze sobą o wiązanie do p166W01. Ponadto Wiązanie 4C5 z p166Chn było podobnie konkurowane tylko samo, ale 3G1 i 5G5 mogły konkurować ze sobą o wiązanie z p166Chn. Te odkrycia wskazywały, że 3G1 i 5G5 rozpoznają te same lub nakładające się epitopy, a 2B1 i 4C5 rozpoznają różne.

jest to pierwsze badanie, które bada różne cechy wspólnych i specyficznych dla genotypu epitopów neutralizacji konformacyjnej HEV. Wykazaliśmy, że wspólne i specyficzne dla genotypu epitopy neutralizujące mogą być niezależne. Odkrycie to jest bardzo korzystne dla wykazania mechanizmów leżących u podstaw niskiej zgodności różnych testów diagnostycznych. Dalsze badania mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia różnych cech epitopów neutralizujących HEV w skuteczności rozwoju diagnostycznego i przygotowania szczepionki.

praca ta była wspierana przez doctoral scientific research foundation of Anhui Medical University (nr 0110037101).

Oświadczenie o ujawnieniu informacji

autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

kontakt z autorem

Szczegóły artykułu / publikacji

Copyright / dawkowanie leku / Disclaimer

Copyright: All rights reserved. Żadna część niniejszej publikacji nie może być tłumaczona na inne języki, powielana lub wykorzystywana w jakiejkolwiek formie lub za pomocą jakichkolwiek środków, elektronicznych lub mechanicznych, w tym kserowania, nagrywania, kopiowania lub za pomocą jakiegokolwiek systemu przechowywania i wyszukiwania informacji, bez pisemnej zgody Wydawcy.
dawkowanie leku: autorzy i wydawca dołożyli wszelkich starań, aby dobór leku i dawkowanie określone w niniejszym tekście były zgodne z aktualnymi zaleceniami i praktyką w momencie publikacji. Jednak w związku z trwającymi badaniami, zmianami w przepisach rządowych i stałym przepływem informacji dotyczących terapii lekowej i reakcji na lek, czytelnik jest proszony o sprawdzenie ulotki dla każdego leku pod kątem jakichkolwiek zmian we wskazaniach i dawkowaniu oraz o dodatkowe ostrzeżenia i środki ostrożności. Jest to szczególnie ważne, gdy zalecanym środkiem jest nowy i/lub rzadko stosowany lek.
Zastrzeżenie: Oświadczenia, opinie i dane zawarte w niniejszej publikacji są wyłącznie oświadczeniami poszczególnych autorów i współpracowników, a nie wydawców i redaktorów. Wyświetlanie reklam lub / i odniesień do produktów w publikacji nie stanowi gwarancji, poparcia lub zatwierdzenia reklamowanych produktów lub Usług ani ich skuteczności, jakości lub bezpieczeństwa. Wydawca i redaktor zrzekają się odpowiedzialności za jakiekolwiek szkody wyrządzone osobom lub mieniu wynikające z pomysłów, metod, instrukcji lub produktów, o których mowa w treści lub reklamach.